Способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в фибробласты

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА В ФИБРОБЛАСТЫ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Богдан Василий Генрихович Гаин Юрий Михайлович Демидчик Юрий Евгеньевич Зафранская Марина Михайловна Багатка Светлана Степановна Шелкович Светлана Евгеньевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в фибробласты, при котором дифференцировку осуществляют путем культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в дифференцировочной среде в присутствии ростовых факторов 10 нг/мл,10 нг/мл, 1 10 нг/мл, 3 5 нг/мл и 0,9 человеческой сыворотки. Изобретение относится к медицине, в частности к клеточной трансплантации, и может быть использовано для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в фибробласты. Наиболее близким, принятым за прототип, является способ дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в фибробласты, включающий культивирование мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в дифференцировочной среде, состоящей из 0,9 эмбриональной телячьей сыворотки, 0,9 лошадиной сыворотки и коктейля ростовых факторов 10 нг/мл , 10 нг/мл , 10 нг/мл 1 1. Недостатком способа являются а) низкий пролиферативный потенциал и гибель некоторого количества клеток в процессе дифференцировки б) неравномерный рост клеточной культуры в предлагаемой дифференцировочной среде в итоге приводит к снижению плотности клеток в культуре в) длительный временной период (до 14 суток), необходимый для достижения монослоя конфлюэнтной культурой клеток. 17567 1 2013.10.30 Задачей настоящего изобретения является повышение пролиферативного потенциала клеток с равномерным активным ростом клеточной культуры, уменьшение времени, необходимого для проведения дифференцировки. Поставленная задача достигается за счет того, что в способе направленной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в фибробласты, при котором дифференцировку осуществляют путем культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека в дифференцировочной среде в присутствии ростовых факторов 10 нг/мл,10 нг/мл, 1 10 нг/мл, 3 5 нг/мл и 0,9 человеческой сыворотки. Сравнительная морфологическая характеристика нестимулированных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) жировой ткани и МСК, культивируемых в условиях дифференцировки в фибробласты в зависимости от способа культивирования. В ходе микроскопического анализа роста клеток уже в первые дни культивирования выявлены значительные изменения морфологии нестимулированных МСК и МСК, культивируемых в среде с ростовыми факторами, характер которых зависел от используемого протокола культивирования. В конфлюэнтных культурах нестимулированных МСК из-за неравномерного роста клеток (типичного для пассируемых культур ранних пассажей) наблюдалось увеличение числа и размеров зон гиперконфлюэнтности, разделенных участками с низкой плотностью клеток. Пролиферативный потенциал был снижен за счет контактного торможения, но протекающие процессы деления клеток отмечались визуально на протяжении всего времени культивирования. В культурах преобладали крупные распластанные клетки фибробластно-подобной морфологии, с четким ядром и ядрышками, развитым цитоскелетом. В гиперконфлюэнтных участках из-за плотного контакта клеток их размер был значительно меньше и они приобретали веретеновидную форму. Клетки, культивируемые согласно протоколу, выбранному в качестве прототипа, в дифференцировочной среде с незначительным количеством сыворотки (0,9 ) и в присутствии факторов роста 3,и 1 формировали равномерный слой со специфическим взаимно параллельным расположением веретеновидных клеток на поверхности культурального пластика. К концу первой недели культивирования происходило значительное изменение морфологии клеток утончение и удлинение псевдоподий клеток, увеличение грануляции цитоплазмы. Низкий пролиферативный потенциал клеток и гибель небольшого количества клеток приводили к снижению плотности клеток в культуре. На заключительном этапе дифференцировки (10-14 дней культивирования) наблюдалось снижение степени адгезии клеток к пластику, что обусловливало спонтанное или механическое открепление небольших участков монослоя конфлюэнтной культуры. На 14-е сутки культивирования культуры нестимулированных МСК и клеток, подвергшихся направленной дифференцировке в фибробласты, были сняты с поверхности культурального пластика для фенотипического и молекулярно-генетического исследования экспрессии тканеспецифических маркеров. В ходе культивирования, согласно заявленному способу дифференцировки (, ,1, 3 и 0,9 человеческой сыворотки), происходило значительное увеличение плотности культуры, при этом численность клеток продолжала нарастать, несмотря на отсутствие свободного пространства на поверхности культурального пластика. На 6-8 сутки культивирования наблюдалась полная потеря адгезивных свойств клеток и открепление гиперконфлюэнтной культуры крупными конгломератами от пластика. По причине образования открепившимися клетками крупных агрегатов, время культивирования было уменьшено до 8 суток. Снятие культуры не требовало дополнительной ферментативной обработки. По окончанию экспериментов по направленной дифференцировке МСК в фибробласты проведено сравнение фенотипа нестимулированных МСК и клеток, культивируемых по двум различным способам в течение 8-14 суток в присутствии 2-х коктейлей факторов 2 17567 1 2013.10.30 роста (, , 1) прототип и (, , 1, 3 и 0,9 человеческой сыворотки) - предлагаемого способа, как показано в таблице. Экспрессиямаркеров МСК в условиях направленной дифференцировки в фибробласты Количество клеток,Культуры МСК ЖТ- 90 105 44 119 7 45 31 34 Нестимулированные МСК ЖТ 2-го пас 98,5 94,8 99,9 96 83,3 0,2 1,5 0,4 98 1,9 сажа МСК 2-го пассажа,дифференцирован 76,7 82,1 90,3 78,5 85,2 0,3 0,7 1,6 96,1 0,1 ные в фибробласты(заявленный способ) После культивирования МСК ЖТ в условиях направленнойдифференцировки в фибробласты согласно протоколу-прототипу наблюдалось снижение количества СБ 90 клеток на 21,8 , согласно заявленному способу - на 82,4 , а также снижение степени экспрессии основного маркера МСК 90 по сравнению с недифференцированными МСК. Следует отметить, что в культуре клеток, культивируемых в условиях направленной дифференцировки в фибробласты, отмечалось также снижение интенсивности флуоресценции моноклональных антител 105,44 и 119 сдо , что также может характеризовать изменение степени экспрессии характерных для МСК маркеров и,следовательно, изменении фенотипа и функции клеток. В отношении остальных маркеров различий в уровнях экспрессии не наблюдалось. Установлена экспрессия данных маркеров как в контрольных культурах МСК так и в МСК, культивируемых в присутствии ростовых факторов. При этом наблюдалось более интенсивное окрашивание клеток, культивируемых в дифференцировочных условиях, за счет высокой плотности клеточных культур. Представленные данные свидетельствуют о высокой практической эффективности предлагаемого способа. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3