Способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ БОЛЬНОМУ С ПАТОЛОГИЕЙ КРОВЕТВОРЕНИЯ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Зафранская Марина Михайловна Усс Анатолий Леонидович Кривенко Светлана Ивановна Нижегородова Дарья Борисовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования РЯБЦЕВА Е.С. и др. Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус. 2006. -1. - С. 81-87. ХУЛУП Г.Я. и др. Состояние и перспективы трансплантологии. Материалы Международной научно-практической конференции. - Минск, 2008. С. 156-161. ЛЕВИН В.И. и др. Иммунопатология,аллергология, инфектология. - 2006.1. - С. 6-8. Современные методы диагностики,лечения и профилактики заболеваний. Сб. инструктивно-методических документов. .2. Лабораторная диагностика. Клиническая фармакология и фармация. Гематология и трансфузиология. - Минск, 2001. - С. 274-292. КОСМАЧЕВА С.М. и др. Достижения медицинской науки Беларуси. Вып.(57) Способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения, заключающийся в том, что получают от одного аллогенного донора мезенхимальные стволовые клетки, а от другого аллогенного донора - мононуклеары периферической крови, окрашивают мононуклеары карбоксифлуоресцеином, культивируют в течение 5 дней в питательной среде,содержащей фитогемагглютинин, мононуклеары периферической крови в присутствии мезенхимальных стволовых клеток и без них, регистрируют фитогемагглютинининдуцированную пролиферацию 3-лимфоцитов в полученных культурах клеток,используя моноклональные антитела к 3 рецептору Т-лимфоцитов, определяют коэффициент супрессии пролиферативного ответа мононуклеаров мезенхимальными стволовыми клеткамив процентах по формуле П 100100 ТМСК 17751 1 2013.12.30 где ПТМСК - показатель пролиферации 3-лимфоцитов в культуре мононуклеаров периферической крови при их культивировании в присутствии мезенхимальных стволовых клеток,ПТ - показатель пролиферации 3-лимфоцитов в культуре мононуклеаров периферической крови при их культивировании без мезенхимальных стволовых клеток,и устанавливают возможность использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения при значенииболее 50 . Изобретение относится к медицине, к разделам гематологии, трансплантологии, клеточной биологии, онкологии. Одним из самых частых и тяжелых осложнений стандартного протокола лечения пациентов с патологией кроветворения, основанного на аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, является развитие реакции трансплантат против хозяина, в результате которой происходит цитотоксическое поражение организма реципиента. Перспективное направление селективного подавления активности цитотоксических Тлимфоцитов при развитии реакции трансплантат против хозяина основано на использовании иммуносупрессивных свойств аллогенных мезенхимальных стволовых клеток донора. Однако проблема применения донорских культур аллогенных мезенхимальных стволовых клеток заключается в индивидуальном различии их иммуносупрессивного потенциала. В связи с этим для определения возможности трансплантации аллогенных мезенхимальных стволовых клеток донора больному с патологией кроветворения необходимо предварительно оценить степень иммуносупрессивного потенциала аллогенных мезенхимальных стволовых клеток донора и определить эффективность их использования. Аналогов не обнаружено. Задачей заявляемого способа является подбор аллогенных мезенхимальных стволовых клеток донорадля определения возможности их трансплантацииольному с патологией кроветворения после проведенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток для предупреждения развития реакции трансплантат против хозяина. Поставленная задача решается следующим способом. Предложен способ определения возможности использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения, заключающийся в том, что получают от одного аллогенного донора мезенхиальные стволовые клетки, а от другого аллогенного донора - мононуклеары периферической крови, окрашивают мононуклеары карбоксифлуоресцеином, культивируют в течение 5 дней в питательной среде, содержащей фитогемагглютинин, мононуклеары периферической крови в присутствии мезенхимальных стволовых клеток и без них, регистрируют фитогемагглютинин-индуцированную пролиферацию-лимфоцитов в полученных культурах клеток, используя моноклональные крови в присутствии мезенхимальных стволовых клеток и без них, регистрируют фитогемагглютинин-индуцированную пролиферацию-лимфоцитов в полученных культурах клеток, используя моноклональные антитела к 3 рецептору -лимфоцитов,определяют коэффициент супрессии пролиферативного ответа мононуклеаров мезенхимальными стволовыми клеткамив процентах по формуле П 100100 ТМСК,ПТ где ПТМСК - показатель пролиферации 3-лимфоцитов в культуре мононуклеаров периферической крови при их культивировании в присутствии мезенхимальных стволовых клеток,ПТ - показатель пролиферации 3-лимфоцитов в культуре мононуклеаров периферической крови при их культивировании без мезенхимальных стволовых клеток,2 17751 1 2013.12.30 и устанавливают возможность использования мезенхимальных стволовых клеток для аллогенной трансплантации больному с патологией кроветворения при значенииболее 50 . Пример 1. Больной А., 33 года, поступил в отделение трансплантации костного мозга с диагнозом хронический миелолейкоз. Больному А. была выполнена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток после предварительно проведенного режима кондиционирования (высокодозной полихимиотерапии) и запланирована трансплантация аллогенных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) донора Б., 27 лет, для предупреждения развития реакции трансплантат против хозяина. Для предварительной оценкииммуносупрессивного потенциала аллогенных МСК был осуществлен забор жировой ткани у донора Б. методом стандартной липосакции и получены мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани ранних (1-4-го) пассажей, а у донора В., 31 год, был осуществлен забор периферической венозной крови и получены мононуклеарные клетки периферической крови (МПК). Аллогенные МСК донора Б. совместно культивировали с МПК донора В., предварительно окрашенными в 1 мл культуральной среды -1640 внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином (7 дМ на 110 клеток/мл) в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре, в соотношении 110 в течение 5 дней в питательной среде (1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки), содержащей 2,5 мкг/мл митогена фитогемагглютинина,в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С. При этом параллельно культивировали МПК донора В. без добавления аллогенных МСК жировой ткани донора Б. в той же среде. Регистрацию митоген-индуцированной пролиферации СБЗ-лимфоцитов донора В. в культуре аллогенных МСК и МПК и в культуре МПК осуществляли на 5-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого клеточные суспензии обеих культур окрашивали моноклональными антителами, меченные флуоресцентной меткой, к 3 рецептору -лимфоцитов в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией пролиферации клеток. Результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Пролиферация СБЗТ-лимфоцитов донора В. в ответ на фитогемагглютинин в присутствии аллогенных МСК жировой ткани донора Б. или в их отсутствие Пролиферация СОЗ-клеток в культуре Пролиферация СОЗ-клеток МПК с добавлением аллогенных МСК жиров культуре МПК,(П) вой ткани донора Б.,(Пмск) Донор В. 49,6 11,1 Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответапо формуле 100 П 11,1 10077,6 .100 МСК 100 П 49,6 Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответасоставил более 50 , что свидетельствует о наличии возможного терапевтического эффекта аллогенных МСК жировой ткани донора Б. при использовании данных клеточных культур для предупреждения развития реакции трансплантат против хозяина у больного с патологией кроветворения после проведенной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. В связи с этим больному А. рекомендовано проведение трансплантации аллогенных МСК, полученных из жировой ткани донора Б., с целью иммунологической супрессии Т-клеточного ответа. Пример 2. Больной Г., 33 года, поступил в отделение трансплантации костного мозга с диагнозом хронический миелолейкоз. Больному Г. была выполнена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток после предварительно проведенного режима кондицио 3 17751 1 2013.12.30 нирования (высокодозной полихимиотерапии) и запланирована трансплантация аллогенных МСК донора Д., 30 лет, для предупреждения развития реакции трансплантат против хозяина. Для предварительной оценкииммуносупрессивного потенциала аллогенных МСК был осуществлен забор жировой ткани у донора Д. методом стандартной липосакции и получены мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани ранних (1-4-го) пассажей, а у донора Е., 29 лет, был осуществлен забор периферической венозной крови и получены мононуклеарные клетки периферической крови (МПК). Аллогенные МСК донора Д. совместно культивировали с МПК донора Е., предварительно окрашенными в 1 мл культуральной среды -1640 внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином (7 цМ на 1107 клеток/мл) в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре, в соотношении 110 в течение 5 дней в питательной среде (1640 с 25 мМ , 2 мМ -глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки), содержащей 2,5 мкг/мл митогена фитогемагглютинина, в увлажненной атмосфере с 52 при 37 С. При этом параллельно культивировали МПК донора Е. без добавления аллогенных МСК жировой ткани донора Д. в той же среде. Регистрацию митоген-индуцированной пролиферации СОЗ-лимфоцитов донора Е. осуществляли на 5-й день культивирования методом проточной цитометрии. Для этого клеточные суспензии обеих культур окрашивали моноклональными антителами, меченные флуоресцентной меткой, к 3 рецептору -лимфоцитов в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией пролиферации клеток. Результаты представлены в табл. 2. Таблица 2 Пролиферация СОЗ-лимфоцитов донора Е. в ответ на фитогемагглютинин в присутствии аллогенных МСК жировой ткани донора Д. или в их отсутствие Пролиферация СОЗклеток в культуре МПК,(П) Пролиферация 3-в культуре МПК с добавлением аллогенных МСК жировой ткани донора Д.,(Пмск) Донор Е. 71,5 50,1 Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответапо формуле П 5010010029,9 .100 МСК 100 П 71,5 Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответасоставил менее 50 , что свидетельствует об отсутствии возможного терапевтического эффекта аллогенных МСК жировой ткани донора Д. при использовании данных клеточных культур для предупреждения развития реакции трансплантат против хозяина у больного с патологией кроветворения после проведенной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. В связи с этим больному Г. не рекомендовано проведение трансплантации аллогенных МСК, полученных из жировой ткани донора Д., с целью иммунологической супрессии -клеточного ответа. Вывод. При определении коэффициента супрессии пролиферативного ответа к более 50 аллогенные МСК жировой ткани донора могут быть использованы для трансплантации больному с патологией кроветворения после проведенной аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток с целью предупреждения развития реакции трансплантат против хозяина. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4