Способ получения липосорбента

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Дрожденюк Анатолий Павлович Макаревич Денис Александрович Вашкевич Ирина Игнатьевна Голубович Владимир Петрович Усанов Сергей Александрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения липосорбента на основе кальция виннокислого и гепарина для очистки плазмы крови от липопротеинов методом колоночной хроматографии, при котором смешивают равные объемы водного раствора, содержащего 6,85 мас.хлорида кальция, и водного раствора, содержащего 8,98 мас.калий-натрия или натрия виннокислого и 0,09 мас.гепарина, перемешивают и отмывают образовавшиеся кристаллы сорбента физиологическим раствором. Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способу получения липосорбента, состоящего из комплекса гепарина и кальция виннокислого ,(Г-КВ) для очистки плазмы крови от липопротеинов. Известен способ удаления липопротеинов из плазмы крови на аппарате, при котором в качестве матрицы используют модифицированную сефарозу 1. В качестве матрицы также используют гранулированную целлюлозу 2, 3. Все эти матрицы обладают существенными недостатками низкая гемосовместимость, необходимость химической модификации с использованием токсичных сшивающих агентов, что обуславливает высокую стоимость гемосорбента. Известен коммерческий гепарин, содержащий сорбент - 4, состоящий из агарозы с иммобилизованным на ней гепарином с использованием эпихлоргидрина в качестве сшивающего реагента. Данный сорбент был использован для выделения антитромбина, а также липопротеинов из плазмы и сыворотки крови, ДНК и РНК полимераз, рецепторов гормонов. Известен способ получения сорбента для очистки биологических жидкостей от липопротеинов 4, основанный на химическом связывании с агарозой глицидилового эфира 17337 1 2013.08.30 полиэтиленгликоля, модифицированного 4-20-алкильной, фенильной или фенилалкильной группой. Недостаток метода - многостадийный синтез сорбента. Задача изобретения - разработка быстрого и рентабельного способа получения липосорбента на основе гепарина и КВ. Настоящее изобретение основано на получении комплексас гепарином. Гепарин гликозаминогликан, который состоит из чередующихся остатков глюкозамина и уроновой кислоты с 1-4 связями. Он является мощным ингибитором свертывания крови,предотвращает образование тромбов. Поставленная задача достигается заявляемым способом получения липосорбента для очистки крови и ее компонентов, а также других биологических жидкостей от липопротеинов, включающим смешивание раствора хлористого кальция с раствором калий-натрия или натрия виннокислого, содержащего гепарин. Варьируя количество гепарина в исходном растворе, можно получать сорбент разной степени модификации. Форма и размер кристаллов контролируется микроскопически и иллюстрируется фиг. 1, на которой изображены форма и размер кристаллов. Линия соответствует 10 мкм. На фиг. 2 приведена электрофореграмма белков, адсорбированных на сорбенте в процессе очистки образцов плазмы крови методом колоночной хроматографии. Электрофорез проведен в 12 полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. 1 - белки - стандарты различной молекулярной массы, 2 - липопротеидные компоненты, связанные сорбентом в процессе очистки. На фиг. 3 приведены результаты тонкослойной хроматографиилипидного материала, адсорбированного на Г-КВ.проведена на пластинах 60 254 в системе растворителей петролейный эфир-этилацетат, объемное соотношение (51). В качестве проявителя использована система растворителей бензальдегид-этиловый спиртсерная кислота, объемное соотношение (0,590,5) при нагревании. 1 - стандарт холестерина, 2 - липидный материал, связанный с сорбентом. В таблице приведены результаты стендовых испытаний эффективности очистки плазмы с использованием полученного сорбента. Для анализа использованы 1 см 3 сорбента и 1 мл плазмы. Исследования проведены на автоматическом анализаторе 60 ( , ). Способ получения сорбента приведен в примере 1. Пример 1. Для получения Г-КВ используются 1. Водный раствор калий-натрия или натрия виннокислого в концентрации 0,3-0,7 ,содержащий 100 мг гепарина. 2. Водный раствор хлористого кальция в концентрации 0,5-0,9 . К 100 мл 0,5 хлористого кальция приливают 100 мл 0,35 раствора калий-натрия виннокислого, содержащего 100 мг гепарина при температуре 20-22 С. После перемешивания на механической мешалке в течение 3-5 мин образовавшимся кристаллам ГЕПАРИН-КВ дают осесть (время оседания 5-10 мин). Полученные кристаллы ГЕПАРИН-КВ промывают физиологическим раствором методом декантации. В результате получают 1822 мл сорбента с размером частиц 20-30 мкм. В процессе синтеза образуется шаровидная структура , содержащая часть молекул гепарина, что подтверждается положительной реакцией с нингидрином. Таким образом, в результате настоящего изобретения, показана возможность получения композиционного сорбента шаровидной формы размером 20-30 мкм, характеризующегося хорошими гидродинамическими свойствами (время оседания частиц 5-10 мин). 17337 1 2013.08.30 Плазма Биохимический показатель Холестерол (ммоль/л) Липопротеины высокой плотности (ммоль/л) Плазма Биохимический показатель Липопротеины низкой плотности (ммоль/л) Липопротеины очень низкой плотности (ммоль/л) Заявляемый способ получения Г-КВ позволяет использовать различные объемы реагирующих растворов с целью увеличения выхода сорбента, соблюдая соотношение растворенных реагентов, что актуально для промышленной технологии получения Г-КВ. В процессе очистки плазмы крови изучена возможность многократного использования сорбента (не менее 5 хроматографических циклов), после его регенерации 0,05 раствором карбоната натрия с целью десорбции связанных липопротеидных компонентов. Источники информации 1.. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4