Способ получения композиционного биопестицида

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИОННОГО БИОПЕСТИЦИДА(71) Заявители Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт защиты растений Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Прищепа Людмила Ивановна Войтка Дмитрий Владимирович Дрожденюк Анатолий Павлович Барановский Александр Вячеславович(73) Патентообладатели Республиканское научное дочернее унитарное предприятие Институт защиты растений Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения композиционного биопестицида на основе биологически активных метаболитов, продуцируемых грибами рода , при котором проводят культивирование гриба, полученную культуральную жидкость фильтруют, добавляют в нее аффинный сорбент, в качестве которого используют хитозан, модифицированный брушитом или фторидом кальция, надосадочную жидкость удаляют, а осадок суспендируют в фосфатном буфере. Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, а именно к способу получения композиционного биопестицида из культуральной жидкости почвенных сапрофитных грибов-антагонистов рода . Основной целью настоящего изобретения является получение биопестицида, состоящего из комплекса гидролитических ферментов и пептидных антибиотиков, продуцируемых грибами рода . Поставленная задача достигается предложенным способом получения композиционного биопестицида, включающим фильтрацию культуральной жидкости, синтез аффинного сорбента, проведение адсорбционной хроматографии с последующим удалением надосадочной жидкости методом декантации. 14345 1 2011.04.30 Для выделения из культуральной жидкости гидролитических ферментов и пептидных антибиотиков используют сорбенты на основе хитозана 1. Сополимер хитозана с брушитом. 2. Сополимер хитозана с фторидом кальция. Исследованные сорбенты характеризуются способностью сорбировать ферменты и пептидные антибиотики, содержащиеся в культуральной жидкости, и могут быть использованы в биотехнологии получения биопестицида. Способ осуществляется следующим образом. Этап 1. Гриб родакультивируют глубинным способом на синтетической среде Чапека при температуре 261 С в течение 10 суток. Культуральную жидкость титруют 2 М раствором гидроокиси натрия до 6,0-6,5 и фильтруют через нейлоновый или стеклянный фильтр с использованием водоструйного насоса или самотеком. Этап 2. Получение аффинных сорбентов. Пример 1. Получение хитозана, модифицированного брушитом (хит-Б). В 500 мл двухзамещенного фосфата натрия приливают смесь, состоящую из 30 мл раствора хитозана (300 мг) в 0,1 н соляной кислоте и 500 мл 0,5 М раствора хлорида кальция, со скоростью 500 мл/ч. После перемешивания в течение 10-20 мин проводят промывку образовавшегося сорбента водой методом декантации или с использованием водоструйного насоса. В результате получают 2 л осевшей в течение 12-15 ч суспензии сорбента (брушит, модифицированный хитозаном). Пример 2. Получение хитозана, модифицированного фторидом кальция (хит-). В 250 мл 0,6 М хлорида кальция, содержащего 25 мл раствора хитозана (250 мг) в 0,1 н соляной кислоте, приливают при перемешивании 500 мл раствора фторида натрия, содержащего 2 мл 2 М раствора едкого натра, перемешивают в течение 10-15 мин. Конечныйреакции - 7,05-7,1. Получают 120 мл осевшей в течение 12-15 часов мелкодисперсной суспензии аффинного сорбента. Этап 3. Получение композиционного биопестицида при использовании в качестве адсорбента хит-Б. В 1 л отфильтрованной культуральной жидкости при 6,8 приливают 500 мл суспензии сорбента, перемешивают в течение 5-10 мин. После осаждения объемом 500-600 мл супернатант удаляют, в осадок приливают 0,5 М раствор калийнатрийфосфатного буфера(8,0) до конечной концентрации 0,05 М. Таким образом получают 60050 мл суспензии композиционного биопестицида, состоящего из аффинного сорбента, адсорбированным на нем комплексом гидролитических ферментов и пептидных антибиотиков, что подтверждается данными, приведенными на фиг. 1 и 2. Добавление фосфатного буфера приводит к частичной десорбции с сорбента ферментов и пептидных антибиотиков. Хитозан, входящий в состав композиционного биопестицида, является индуктором защитных систем растений, включает усиление синтеза антипатогенных белков и ферментов болезнеустойчивости, в том числе хитиназ, -глюконаз, пероксидаз. В связи с тем, что хитозан и брушит являются биодеградируемыми материалами, полученный композиционный биопестицид характеризуется пролонгированным действием, что повышает общий защитный эффект против возбудителей болезней. Этап 4. Для экспериментальной проверки эффективности биопестицида, полученного по заявляемому способу, исследовали его антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным микромицетам в условияхи биологическую эффективность в полевых условиях. Изучено действие биопестицида на рост и развитие фитопатогенных микроорганизмов,,. Биопестицид добавляли в питательную среду в разведениях 110, 1100, 11000, 110000. Контроль - стерильная ди 2 14345 1 2011.04.30 стиллированная вода. В опыте анализировали культурально-морфологические признаки фитопатогенов высоту мицелия, глубину пигментирования субстрата. Антагонистическая активность характеризует ингибирование роста в процентах к контролю. Результаты эксперимента показали, что биопестицид в разведении 1100 и 11000 эффективно подавляет возбудителей болезней. Уменьшение высоты мицелия в сравнении с контролем составило для .- 5,0 для .- 4,5 для .- 2,0 мм. Ингибирование роста в отношении указанных фитопатогенов достигало 89,5 . Об ингибирующем действии биопестицида свидетельствует также уменьшение или отсутствие пигментирования питательной среды для микроорганизмов, обладающих данной особенностью (. , . ). При использовании биопестицида в практике защиты растений его разводят водой в 100-120 раз. Применение биопестицида в технологии защиты огурца от болезней показало, что профилактическая обработка после высадки рассады в теплицу позволила сдержать проявление первых симптомов корневой гнили. Так, при учете 15.06 распространенность и развитие болезни в контроле составили 3,2 и 0,8 соответственно, в то время как в вариантах с применением препарата симптомы болезни отсутствовали. Биологическая эффективность биопестицида при учете в конце вегетации составила 40,4-48,7 , что позволило снизить распространенность корневой гнили в 1,4-1,5 раза,развитие болезни - в 1,7-2 раза.-электрофорез в 12-ном ПААГ белковой фракции культуральной жидкости,связанной с аффинным сорбентом, осажденной сульфатом аммония 50-ного(1) и 70-ного (2) насыщения Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4