Сорбент для извлечения из биологических жидкостей бактериальных эндотоксинов и способ его получения

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СОРБЕНТ ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Гапанович Владимир Николаевич Бычко Галина Николаевна Расюк Елена Дмитриевна Мельнова Наталья Ивановна Чехольский Анатолий Семенович Самойленко Светлана Геннадьевна Голубович Владимир Петрович Поликарпова Валентина Ивановна Мартинович Вера Павловна Кирковский Валерий Васильевич Старостин Александр Валерьянович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гематологии и трансфузиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) 1. Сорбент для извлечения из биологических жидкостей бактериальных эндотоксинов,представляющий собой полиакриламидный гель с иммобилизованным на нем полимиксином, в котором участок полимерной цепи с лигандом представлен формулой 2, Полимиксин В где 1-70 - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации полимиксиновых лигандов, а число участков цепи с лигандом составляет 50-10000, при этом сорбент содержит полиакриламид, полимиксин и воду при следующем их соотношении, мас.полиакриламид 5-10 полимиксин 0,1-0,5 вода остальное. 15108 1 2011.12.30 2. Способ получения сорбента для извлечения из биологических жидкостей бактериальных эндотоксинов по п. 1, заключающийся в том, что к мономерам акриламиду и метиленбисакриламиду, растворенным в 2 -ном растворе бикарбоната натрия, добавляют ацилированный акрилоилхлоридом полимиксин, растворенный в 2 -ном растворе бикарбоната натрия, к полученной смеси добавляют персульфат аммония и тетраметилендиамин, полученный гель измельчают и многократно промывают дистиллированной водой и хлоридом натрия. Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины и может быть использовано для избирательной сорбции бактериальных эндотоксинов и детоксикации организма при лечении сепсисов, перитонитов и других заболеваний с синдромом интоксикации, а также для извлечения эндотоксинов из различных биологических жидкостей. Пептидный антибиотик полимиксин инактивирует эндотоксины полилипосахаридной природы, продуцируемые грамотрицательными бактериями. Однако его использование в медицине ограничено из-за токсичного влияния на почки. Для уменьшения токсичных эффектов было предложено использовать иммобилизацию полимиксина (полимиксин ,полимиксин /колистин и др.) на полимерные носители. Известен сорбент, полученный ковалентной иммобилизацией полимиксинана силохром, который предварительно был активирован введением альдегидных групп 1. В опытахбыла показана способность этого сорбента извлекать микробный токсин с антигенными свойствами из плазмы и эритроцитов, что способствовало сохранению процентного состава популяции -лимфоцитов, экспрессирующих на мембране рецепторы типак иммуноноглобулинами . Недостатком данного сорбента является его низкая гемосовместимость и невозможность использования в непосредственных контактах с цельной кровью. Наиболее близким к настоящему изобретению является сорбент, матрица которого представляет собой полистирольные волокна, в которые были введены -хлорацетамидометильные или сукцинилированные -ацетамидометильные группы, необходимые для иммобилизации полимиксина 2. Он был иммобилизован на эти волокна с использованием производных карбодиимида (дициклогексилкарбодиимида и 1-этил-3(3-диметиламинопропил)-карбодиимида) в качестве конденсирующих агентов или инкубированием с-хлорацетамидометильными волокнами прибольше 7. В экспериментах с лабораторными животными (мышами, собаками) показано, что этот сорбент эффективен при лечении животных с бактериальным сепсисом. В дальнейшем авторы провели клинические исследования сорбента при лечении различных интоксикаций и показали его эффективность относительно различных эндотоксемий у людей 3-4. Недостатком сорбента на модифицированном полистирольном волокне является то,что он создан в основном для лабораторных исследований и не находит широкого применения в клинической практике из-за сложности получения, невозможности стандартизации,высокой стоимости. Полистирольная матрица из-за высокой гидрофобности не является полностью биологически инертной. Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения сорбента для избирательного выделения активатора плазминогена тканевого типа, заключающийся в том, что к раствору гепарина добавляли раствор гидрокарбоната натрия при перемешивании и слабом нагревании при 30 С 5. В полученную смесь вносили акрилоилхлорид,смесь энергично перемешивали при той же температуре, затем добавляли акриламид и,-метиленбисакриламид. Полученную смесь перемешивали до полного растворения компонентов, а затем в нее добавляли -тетраметилендиамин и персульфат аммония и оставляли для полимеризации, которая происходила спустя 1,5-2 мин. 2 15108 1 2011.12.30 Известный способ не может быть принят в качестве прототипа, так как не имеет общих признаков с заявляемым. Отличие состоит в различной химической структуре лигандов гепарин является полисахаридом, а полимиксин - полипептидом. Вследствие этого способ иммобилизации лигандов на полимерной матрице также различен. В заявляемом сорбенте полимиксин ковалентно иммобилизуют на матрице за счет образования амидной связи между-аминогруппами диаминомасляной кислоты и карбоксилом полиакриламидной цепи. Задачей изобретения является получение биологически активного сорбента для экстракорпоральной избирательной сорбции бактериальных липополисахаридов, подавляющего патологические проявления интоксикаций в биологических жидкостях, плазме и цельной крови больных с различными типами бактериальных интоксикаций, исключение нейро- и гепатотоксического действия. Ковалентное селективное связывание молекул полимиксина позволяет исключить возможность нейро- и гепатотоксического действия полимиксина. Поставленная задача достигается за счет того, что сорбент для извлечения бактериальных эндотоксинов представляет собой полиакриламидный гель с иммобилизованным на нем поликсимином, в котором участок полимерной цепи с лигандом представлен формулой 2, Полимиксин В где 1-70 - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации полимиксиновых лигандов, а число участков цепи с лигандом составляет 50-10000, при этом сорбент содержит полиакриламид, полимиксин и воду при следующем их соотношении, мас.полиакриламид 5-10 полимиксин 0,1-0,5 вода остальное. Поставленная задача решается за счет того, что для получения сорбента для извлечения из биологических жидкостей бактериальных эндотоксинов к мономерам акриламиду и метиленбисакриламиду, растворенным в 2 -ном растворе бикарбоната натрия, добавляют ацилированный акрилоилхлоридом полимиксин, растворенный в 2 -ном растворе бикарбоната натрия, к полученной смеси добавляют персульфат аммония и тетраметилендиамин, полученный гель измельчают и многократно промывают дистиллированной водой и хлоридом натрия. Выбор полиакриламидной матрицы обусловлен ее стабильностью, биологической инертностью, возможностью введения лиганда на стадии полимеризации. Для превращения полимиксина в мономер проводят его ацилирование акрилоилхлоридом, получая акрилоильное производное по -аминогруппам остатков диаминомасляной кислоты. Способ получения сорбента приведен в примере. Пример 0,100 г ацилированного полимиксина растворяют при перемешивании в 10 мл 2 раствора бикарбоната натрия, в раствор прибавляют каплями при перемешивании 0,12 мл 10 раствора акрилоилхлорида в диоксане и перемешивают раствор магнитной мешалкой в течение 30 мин. Отдельно готовят раствор мономеров для получения полиакриламидного геля в 40 мл 2 раствора бикарбоната натрия последовательно вносят 4,5 г акриламида, 0,5 г метиленбисакриламида. Объединяют полученный раствор с раствором ацилированного полимиксина, прибавляют 0,18 г персульфата аммония и 0,12 мл тетраме 3 15108 1 2011.12.30 тилендиамина. Все компоненты перемешивают и оставляют для полимеризации, которая происходит спустя 3-5 мин. Полимеризованный гель оставляют на 30 мин, затем измельчают с использованием сита из нержавеющей стали с размером ячеек 33 мм, гранулы промывают многократно дистиллированной водой (общий объем 3 л), а затем 0,9(общий объем 1,5 л). Полноту отмывания контролируют измерением оптической плотности промывных вод на спектрофотометре в области 300-380 нм. Отмытый сорбент хранят в 0,9 в холодильнике. В полученном сорбенте полимиксин ковалентно иммобилизован на матрице за счет образования амидной связи между -аминогруппами диаминомасляной кислоты и карбоксилом полиакриламидной цепи. Контроль содержания полимиксина в полимеризованном геле проводят по стандартной методике кислотно-основного титрования. 1 мл отмытого геля помещают в пробирку для центрифугирования, добавляют 9 мл 0,1 н., тщательно перемешивают в течение 5 мин и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В данной операции аминогруппы переводят в солевую форму. Супернатант отделяют, гель промывают водой, добавляя в пробирку 10 мл, тщательно взбалтывают и центрифугируют в тех же условиях. Операцию промывания и центрифугирования повторяют 3-4 раза до нейтральной реакции промывных вод. К промытому гелю добавляют 2 мл 0,1 н. раствораи 7 мл воды до 10 мл общего объема, все тщательно перемешивают. Отбирают 2 мл надосадочной жидкости и титруют ее 0,02 н.с метилоранжем. Титрование повторяют два раза. Рассчитывают количество связавшегося , которое эквивалентно количеству аминогрупп на геле. Данным контролем доказано, что все количество внесенного полимиксина присоединилось к полиакриламидному гелю. Полученный сорбент соответствует требованиям ГОСТ 20790-93. Данные по органолептическим, физико-химическим и биологическим показателям заявляемого сорбента приведены в таблице. Основные свойства заявляемого сорбента Значение показателя сорбента Наименование показателей и ед. измерения п/п(соответствует норме) 1 Внешний вид Полиакриламидный гидрогель, сформированный в виде волокон и гранул,светло-серого цвета, без посторонних включений, полностью покрытый раствором по всему объему модуля для сорбции. Индивидуальная упаковка внутри не должна иметь следов влаги 2 Водородный показательраствора 0,9 От 5,0 до 7,0 хлорида натрия для инъекций, которым заполнен модуль для сорбции с биоспецифическим полиакриламидным гидрогелем 3 Потеря массы биоспецифического полиакриОт 83 до 93 ламидного гидрогеля при высушивании,4 Эндотоксинсвязывающая способность 0,5 биоспецифического полиакриламидного гидрогеля (удельная сорбционная емкость),мкг/мл, не менее 5 Испытание на стерильность Стерильно 6 Испытание на пирогенность Апирогенно 7 Объем биоспецифического полиакриламид- От 25 до 70 или другой в зависимости от ного гидрогеля в модуле для сорбции, мл объема используемого массообменника 4 15108 1 2011.12.30 Введение раствора сублетальной дозы эндотоксина экспериментальным животным после его инкубации с сорбентом не оказывало влияния на организм кроликов, что подтверждалось стабильностью показателей артериального давления и свидетельствовало об эффективной элиминации эндотоксина. Таким образом, заявляемый способ получения сорбента, сутью которого является ковалентная иммобилизизация полимиксина на полиакриламидной матрице за счет образования амидной связи между -аминогруппами диаминомасляной кислоты и карбоксилом полиакриламидной цепи, отличается простотой получения, обеспечивает невысокую стоимость получаемого сорбента. Используемая матрица является биологически инертной в отличие от используемых ранее полистирольной и силохромной. Сорбент отличается высокой эндотоксинсвязывающей способностью, сорбирует из плазмы крови не менее 0,5 мг/мл геля эндотоксинов. Источники информации 1. Кулаев Д.В., Силантьева О.В., Лопухин Ю.М. Нарушения иммунитета и их коррекция с применением полимиксинового сорбента при разлитом перитоните // Иммунология. 1993. -3. - С. 40-43. 2.К.,Т.,.// ,. - 1989. - . 168. - о. 1. . 323-331. 3..,.,.,.-// . . . - 1994. - . 167. . 4. - . 412-417. 4..,.,. . .--//. - 1995. - . 96. - . 5. . 277-285. 5. Патент РБ на изобретение 8773 Биоафинный сорбент для избирательного выделения активатора плазминогена тканевого типа, МПК 01 30/48, опубл. 2005.09.30. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5