Способ получения сорбента для выделения ДНК

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Дрожденюк Анатолий Павлович Гилеп Андрей Александрович Сергеев Геннадий Валерьевич Синелев Василий Андреевич Усанов Сергей Александрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения сорбента для выделения ДНК, при котором смешивают равные объемы водного раствора, содержащего 6,8 мас.хлорида кальция, 0,09 мас.хитозана и 0,03 мас.соляной кислоты и водного раствора, содержащего 8,98 мас.калий-натрия или натрия виннокислого и 0,07 мас.гидроксида натрия, перемешивают, отделяют часть супернатанта декантацией, стабилизируют образовавшиеся частицы сорбента добавлением эпихлоргидрина и промывают полученный сорбент дистиллированной водой до нейтральных значений . 14225 1 2011.04.30 Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения сорбента (ХИТ-КВ), состоящего из комплекса хитозана (ХИТ) и кальция виннокислого (КВ) для выделения ДНК. Известен способ получения сорбента на основе КВ, который характеризуется тем, что позволяет получать кристаллы сорбента шаровидной формы размером 35-200 мкм 1 и может быть использован для выделения биополимеров, в том числе ДНК. Известен способ получения модифицированного хитозана, используемого для выделения ДНК 2, заключающийся в том, что 10 мг хитозана растворяют в подкисленной воде и 50 мМ имидазоле, в раствор прибавляют 10 мг карбоксилированных полистерольных магнитных частиц и 20 мг водорастворимого карбодиимида в 50 мМ имидазоле 5,5. После инкубации в течение ночи частицы промывают и суспендируют в 10 мМ растворе 2 морфолиноэтанол сульфоновой кислоты 5 . Образец крови инкубируют с равным объемом , содержащей 1 твин 20, протеазу (200 мкг/мл) и 1 мМ ЭДТА. После инкубации лизат крови переносят в пробирку, содержащую модифицированные полистирольные частицы. Иммобилизованную ДНК промывают буфером, содержащим 10 мМ 5, 1 Твин 20 и 1 мМ ЭДТА до исчезновения окраски в промывочном буфере. После промывки частицы сушат воздухом и связанную ДНК элюируют 10 мМ Трис ,8,5. Недостататок данного способа - использование сложной реагентной базы, магнитного оборудования и длительность процесса. Известен также способ получения хитозансодержащих сорбентов на основе силикагеля 3. Модификацию силикагеля 300 (средний размер частиц 5 мкм) осуществляют физической адсорбцией на нем низкомолекулярного хитозана после предварительной обработки силикагеля солями медиили железа . Указанные сорбенты могут быть использованы в аналитической жидкостной хроматографии для разделения неполярных (бензол, толуол) и полярных (нитроанилины, пара-нитрофенол) соединений. Задача изобретения - разработка способа получения сорбента на основе хитозана и КВ для выделения ДНК. Настоящее изобретение основано на получении комплекса КВ с хитозаном - природным полимером (поли- (1-4)-2-амино-2-дезокси 1 глюкопироназа), получаемым в результате дезацетилирования хитина. В соответствии с химической природой хитозана разделение на нем может быть обусловлено следующим взаимодействием анионным обменом с протонированной аминогруппой, адсорбцией на гидроксильных группах, образованием хелатных комплексов. Сорбенты для хроматографии на основе хитозана должны быть жесткими. Для получения неподвижных фаз на основе производных хитозана возможна как физическая адсорбция, так и химическое закрепление производных хитозана на силикагеле 3 или на карбоксилированных полистирольных магнитных частицах 2. Поставленная задача достигается заявляемым способом получения сорбента для выделения ДНК, включающим смешивание раствора хлористого кальция, содержащего хитозан, с раствором калий-натрия или натрия виннокислого, содержащего гидроксид натрия,с последующей стабилизацией образовавшихся кристаллов сорбента обработкой сшивающим агентом. Варьируя количество хитозана и гидроксида натрия в исходных растворах можно получать сорбент разной степени модификации. Форма и размер кристаллов контролируется микроскопически и иллюстрируется фиг. 1, на которой изображены форма и размер кристаллов. Линия соответствует 10 мкм. На фиг. 2 приведена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК из слюны человека, выделенная с использованием ХИТКВ. На фиг. 3 приведены результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) геномной ДНК, выделенной с использованием заявляемого сорбента. Способ получения сорбента приведен в примере 1. 14225 1 2011.04.30 Пример 1. Для получения ХИТ-КВ используются 1. Водный раствор калий-натрия или натрия виннокислого в концентрации 0,3-0,7 М. 2. 2 М раствор гидроксида натрия. 3. Водный раствор хлористого кальция в концентрации 0,5-0,9 М. 4. Раствор хитозана (70 дезацетилирования, молекулярная масса 110 кДа) в 0,1 н соляной кислоте в концентрации 10-15 мг/мл. К 100 мл 0,5 М хлористого кальция, содержащего 10 мл раствора хитозана в 0,1 н соляной кислоты (концентрация 10 мг/мл) приливают 100 мл 0,35 М раствора калий-натрия виннокислого, содержащего 1 мл 2 М раствора гидроксида натрия, при температуре 2022 С. После перемешивания на механической мешалке в течение 3-5 мин образовавшимся кристаллам ХИТ-КВ дают осесть (время оседания 2-3 мин). Для стабилизации сорбента при декантации оставляют 10 мл супернатанта, прибавляют 0,5 мл эпихлоргидрина и 0,2 мл раствора гидроксида натрия, перемешивают в течение 2-3 ч. Полученные кристаллы ХИТ-КВ промывают дистиллированной водой до нейтральных значений . В результате получают 20 мл сорбента с размером частиц 20-30 мкм. В процессе синтеза образуется шаровидная структура КВ, содержащая часть молекул хитозана, имеющего свободные аминогруппы, что подтверждается положительной реакцией с нингидрином. Методом элементного анализа установлено, что содержание в сорбенте углерода 19,07 , кислорода - 59,63 , водорода - 4,69 , кальция - 16,58 . В связи с тем, что содержание хитозана в ХИТ-КВ составляет 0,7 , что рассчитано по сухой навеске сорбента и количеству хитозана, взятого в реакцию, определение азота из-за низкой чувствительности метода элементного анализа не представляется возможным. Таким образом, в результате настоящего изобретения, показана возможность получения сорбента шаровидной формы размером 20-30 мкм, характеризующегося хорошими седиментационными свойствами (время оседания частиц 2-3 мин). Наряду с этим, наличие 2 - групп ( 6,5) позволяет использовать ХИТ-КВ как ионообменник при хроматографии биомолекул, несущих отрицательный заряд при нейтральных значениях , например, нуклеиновые кислоты, в частности ДНК. Применение заявляемого сорбента для выделения ДНК из биологического материала приведено в примерах 2, 3, 4. Пример 2. Выделение ДНК из крови. В 100 мкл цельной крови прибавляют 10 мкл 1 раствора додецилсульфата натрия, приготовленного на 0,05 М натрий цитратном буфере,6,3 (ЦБ). После перемешивания выдерживают 1-2 мин при 70 С. В полученный лизат прибавляют 110 мкл 2 М раствора хлористого калия, содержащего ЦБ (раствор 1), перемешивают и прибавляют 200 мкл суспензии ХИТ-КВ в растворе 1, разведенном в 2 раза (раствор 2). Полученную смесь перемешивают. Сорбенту дают осесть (время оседания частиц 0,5-1,0 мин). Супернатант удаляют пипетированием, осадок промывают дважды 0,5 мл раствора 2 и 1 мл дистиллированной воды. Связавшуюся с сорбентом ДНК элюируют 50 мкл 0,01 М раствора гидроксида натрия и нейтрализуют прибавлением 10 мкл 0,5 М трисбуфера,8. Время выделения ДНК не более 10-15 мин. Пример 3. Выделение ДНК из слюны человека. Мазок слизистой оболочки ротовой полости суспендируют в 200 мкл 0,1, приготовленного на ЦБ. После перемешивания, лизат клеток выдерживают 1-2 мин при 70 С. В полученный лизат прибавляют 200 мкл раствора 1, далее последовательность операций как в примере 2. На фиг. 2. приведена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК при различных концентрациях матрицы. Использованы специфические олигонуклеотид 3 14225 1 2011.04.30 ные праймеры к участку гена эндотелиальной -синтетазы (3) длина ампликона 248 пар оснований ДНК. К-отрицательный контроль. Пример 4. Выделение ДНК из сухого стафилококкового реагента, содержащего белок А. Лиофильно высушенный препарат стафилококкового реагента растворяют в 500 мкл дистиллированной воды, прибавляют 100 мкл 1 раствора додецилсульфата натрия, отбирают пробу в объеме 110 мкл и далее последовательность операций выделения ДНК как в примере 2. На фиг. 3 приведены результаты ПЦР реакции геномной ДНК, выделенной из стафилококкового реагента. 1 - амплификация участкапротеина А (длина ПЦР продукта составляет 480 пар оснований). 2 - амплификация участкапротеина А (отрицательный контроль - без добавления геномной ДНК). 3 - амплификация участка 23(длина ПЦР продукта составляет 900 пар оснований). 4 - амплификация участка 23(отрицательный контроль). ст. - молекулярные ДНК-стандарты (длина стандартов составляет 1000, 700, 500, 300,200 пар оснований). Заявляемый способ получения ХИТ-КВ позволяет использовать различные объемы реагирующих растворов с целью увеличения выхода сорбента, соблюдая концентрацию растворенных реагентов. Способ позволяет получать сорбент с разным количественным содержанием хитозана разной молекулярной массы (30-550 к), соблюдая соотношение соляной кислоты и гидроксида натрия в исходных растворах. Кроме того, благодаря хорошим седиментационным свойствам сорбента, исключается стадия центрифугирования и сокращено время выделения ДНК. Источники информации 1. А. с. СССР 1197725, МПК 01 20/00, 1985. 2. Патент США 6,914,137, МПК 07 021/О 4, 2005. 3. Вестн. Моск. УН-ТА. - Сер.2. Химия. - 2004. - Т. 45. -3. - . 180-186. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4