Штамм Pasteurella multocida серовариант В КМИЭВ-68 – штамм-антиген

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Бирман Борис Яковлевич Полоз Светлана Васильевна Андрусевич Андрей Сергеевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(56) РУСТАМОВ Ю.М. Антигенные, вирулентные и иммуногенные свойства Пастерелла мультоцида различных серологических вариантов (типов). Автореферат диссертации. - М., 1983. . 8-13, 16-24. СТРЕЛЬЧЕНЯ И.И. Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. - 2006. -2. - . 32-34. ЛЯХ Ю.Г. и др. Современные технологии сельскохозяйственного производства. Материалымеждународной научно-практической конференции. Гродно, 2007. - . 250-251.(57) Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к биотехнологии,и касается штамма, предназначенного для конструирования диагностических и лечебнопрофилактических биопрепаратов. Известен штамм 656 серовариант В, накопление которого при культивировании на МПБ (мясо-пептонном бульоне) составляет при стационарном режиме 1,29 млрд. м.т./мл, при постоянном помешивании - 2,96 млрд. м.т./мл на МПБ с добавлением сыворотки и глюкозы составляет при стационарном режиме 2,8 млрд. м.т./мл при шуттелировании - 3,48 млрд. м.т./мл, антигенная активность которого составляет 8 2 1. На бульоне данный штамм дает равномерное помутнение среды, на агаре - мелкие нежные полупрозрачные колонии, на средах Гиса отмечают без образования газа ферментацию глюкозы, сахарозы, сорбита, маннита, галактозы, левулезы и отсутствие ферментации лактозы, раффинозы, арабинозы, мальтозы, ксилозы, дульцита. Штамм образовывает индол и сероводород 1. Данный штамм обладает недостаточным накоплением бактериальной массы и низкой антигенной активностью для изготовления биопрепаратов в больших объемах. Известен штаммсероварианта В, исходные культуры которого обладали слабой вирулентностью значение 50 которого составляет 0,8109 микробных 13084 1 2010.04.30 клеток после пассажа на питательные среды с добавлением 10 сыворотки крови лошади, вирулентность их также не повышалась, увеличения вирулентности достигали путем пассажа через организм белых мышей и кроликов 2. Недостатком данного штамма является возможность реверсии к первоначальным свойствам, то есть к ослаблению вирулентности, что при изготовлении вакцин из такого штамма может привести к снижению иммуногенной активности, а следовательно, и защитных свойств. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма, обладающего способностью высокого накопления бактериальной массы, обладающего способностью длительно сохранять высокую вирулентность и более высокой антигенной активностью. Поставленная задача достигается тем, что штаммсеровариант В КМИЭВ-68 - штамм-антиген. Выделен из легочной ткани больного пастереллезом песца в 2006 г. ЧУП Бобруйское зверохозяйство Белкоопсоюза Бобруйского района Могилевской области. Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 - штамм-антиген - депонирован в коллекции микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского. Коллекционный номер КМИЭВ-68. Таксономическая принадлежность. Микроорганизм отнесен к видусеровариант В семейства . Патогенность для животных. Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 штамм-антиген - патогенен для пушных зверей и лабораторных животных, при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г и молодняка песца. Культурально-морфологические признаки. При микроскопии мазков, приготовленных из бульонных и агаровых культур, окрашенных по Граму, данный микроорганизм имеет вид мелких грамотрицательных кокко-овоидов, размером 0,23-1,20,14-0,2 мкм, имеющих изолированное, парное расположение, иногда цепочное. Культура пастерелл спор не образует, неподвижна, имеет капсулу. На бульоне рост определяется в виде равномерного помутнения с образованием пристеночного кольца. На сывороточном МПА образует серовато-белые колонии с ровными краями, диаметром 1-2 мм. На агаровых средах пастереллы имеют вид нежных, мелких росинчатых колоний, дающих радужное свечение в косопроходящем свете. Биохимические свойства. Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 штамм-антиген - обладает способностью ферментировать глюкозу, галактозу, сахарозу,ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты без газа. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, на индол - положительная. Не обладает гемолитическими свойствами. Антигенный состав. Имеет в своем составе К- и О-антигены. Другие особенности и маркерные свойства. Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 - штамм-антиген - образовывает слабый хлопьевидный флоккулят при взаимодействии с раствором акрифлавина в разведении 11000. При встряхивании он разбивается. Условия хранения. Хранят в ампулах после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде при температуре 24 С в течение 5 лет. Сохранность культуры обеспечивается путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера, МПА на основе перевара Хоттингера 1 раз в течение месяца. Антигенные свойства. Антигенная активность штаммасероварианта В КМИЭВ-68 - штамма-антигена - в РНГА составляет 9 2. Иммуногенность. Иммуногенность штаммасероварианта В КМИЭВ-68 - штамма-антигена - составляет 95 . Вирулентность. Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 - штаммантиген - обладает высокой вирулентностью, 50 которого составляет 0,23109 м.к. 2 13084 1 2010.04.30 Устойчивость к антибиотикам. Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 штамм-антиген - чувствителен к следующим антибактериальным препаратам норфлоксацину, цефатоксиму, энроксилу, цефалексину, рифампицину, амоксициллину. 1. Пример выделения штаммасероварианта В КМИЭВ-68 штамма-антигена. Штаммсеровариант В КМИЭВ-68 - штамм-антиген - выделяли путем посева кусочков патологически измененных легких пушных зверей, больных пастереллезом, на МПБ с добавлением 10 дрожжевого экстракта. Пробирки оставляли в термостате при 37 С на 12-18 ч. Через указанное время отмечали помутнение среды и появление специфического запаха. 2. Пример культивирования штаммасероварианта В КМИЭВ-68 - штамма-антигена. Выращивание данного штамма осуществляли во флаконах на питательной среде МПБ и МПБ с добавлением стерильной сыворотки лошади и глюкозы при 37 С в стационарном режиме и на шуттель-аппарате при 120 колебаниях в минуту в течение 24 ч. Контроль накопления пастерелл осуществляли фотометрическим методом. Результаты исследований отображены в таблице. Накопление пастерелл в зависимости от условий культивирования (млрд. м.т./мл) Режим культивирования Стационарное Шуттелирование Питательная среда Известный Известный КМИЭВ-68 КМИЭВ-68 штамм штамм МПБ 1,29 2,14 2,96 4,12 МПБсывороткаглюкоза 2,8 3,32 3,48 4,92 Таким образом, накопление пастерелл на питательной среде МПБ при стационарном режиме культивирования составило 2,14 млрд. м.т./мл, при шуттелировании 4,12 млрд. м.т./мл. На МПБ с добавлением сыворотки и глюкозы при стационарном режиме составило 3,32 млрд. м.т./мл, с шуттелированием - 4,92 млрд. м.т./мл. 3. Пример определения вирулентных свойств штаммасероварианта В КМИЭВ-68 - штамма-антигена. Вирулентные свойства изучали в опытах на белых мышах живой массой 14-16 г, с этой целью готовили суспензию суточной агаровой культуры данного штамма в физиологическом растворе натрия хлорида. Животных заражали десятикратными разведениями подкожно в области спины в дозе 0,5 мл. За опытными животными вели наблюдение в течение 10 суток после заражения. На каждую заражающую дозу использовали по животных. Расчет 50 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина, результаты исследований показали, что 50 штаммасероварианта В КМИЭВ-68 штамма-антигена составила 0,23109 микробных клеток. 4. Пример определения антигенной активности штаммасероварианта В КМИЭВ-68 - штамма-антигена. Антигенные свойства изучали в реакции непрямой гемагглютинации в разведении сыворотки до 1024. В качестве антигена использовали бактериальную культуру штаммаВ КМИЭВ-68 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что антигенная активность штаммаВ КМИЭВ-68 - штамма-антигена составляет 9 2. Таким образом, штаммсеровариант В КМИЭВ-68 - штаммантиген - обладает накоплением бактериальной массы для изготовления вакцины в объеме 4,92 млрд. м.т./мл, что в 1,4 раз больше по сравнению с известным штаммом, и обладает 3 13084 1 2010.04.30 способностью сохранять длительно высокую вирулентность 50 0,23109 (у известного штамма 0,8109) и более высокой антигенной активностью 9 2 (у известного штамма 8 2) и может быть использован для конструирования профилактических и диагностических препаратов в качестве штамма-антигена. Источники информации 1. Коломнина Г.Ф, Антонова Н.И., Нецепляева Л.И., Семенютина Г.А., Блехерман Б.Е. Влияние различных условий культивирования на рост// Бюл. ВИЭВ. 1988. - Т. 65.- С. 31-34. 2. Рустамов Ю.М. Антигенные, вирулентные и иммуногенные свойства пастерелла мультоцида различных серологических вариантов (типов) Автореф. дис канд. вет. наук. М., 1983. - 25 с. (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4