Штамм Pasteurella multocida серовариант A КМИЭВ-67 – штамм-антиген

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Бирман Борис Яковлевич Полоз Светлана Васильевна Андрусевич Андрей Сергеевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(56) ПОПОВА Т.Е. и др. Биотехнология. 2000. -4. - С. 15-21. СТРЕЛЬЧЕНЯ И.И. Эпизоотология,иммунобиология, фармакология и санитария. - 2006. -2. - С. 32-34. ЛЯХ Ю.Г. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины,2006. Т. 42. Вып. 2. - Ч. 2. - С. 145-147. ЛЯХ Ю.Г. и др. Материалы конференции Современные технологии сельскохозяйственного производства.международная научно-практическая конференция. - Гродно, 2007. - С. 250251. КОЛОМНИНА Г.Ф. и др. Научные основы производства ветеринарных препаратов. Сборник научных трудов. М., 1989. - С. 78-82.(57) Штаммсеровариант А КМИЭВ-67 - штамм-антиген. Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма,предназначенного для конструирования вакцины против пастереллеза пушных зверей,средств специфической профилактики и лечения. Известен штаммсероварианта А, максимальная удельная скорость роста которого в процессе культивирования составляет 1,45 л/ч, а минимальное время генерации - 0,48 ч 1. Известен штаммсероварианта А, который содержит следующий состав белок - 0,186 мг/мл, углеводы - 0,110 мг/мл, нуклеиновые кислоты - 0,07 мг/мл. Иммуногенность которого составляет 80 . Антигенная активность - 7 2 2. Однако эти известные штаммы обладают другим количественным составом белковых и углеводных компонентов с примесями нуклеиновых кислот и недостаточными ростовыми свойствами и низкой иммуногенностью и антигенной активностью. Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма с большим количественным составом белкового компонента, обладающего луч 13085 1 2010.04.30 шими ростовыми свойствами, более высокой иммуногенностью и антигенной активностью. Поставленная задача достигается тем, что штамм выделен из легочной ткани больной пастереллезом норки в 2006 году в Молодечненском отделении Звероводство ЧУП Белкоопвнешторг Белкоопсоюза Молодечненского района Минской области. Таксономическая принадлежность. Микроорганизм отнесен к видусеровариант А семейства . Патогенность для животных. Штамм патогенен для пушных зверей и лабораторных животных, при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г и молодняка норок. Культурально-морфологические признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, данный микроорганизм при окрашивании по Граму располагается в виде мелких грамотрицательных кокко-овоидов, размером 0,28-1,45 х 0,15-0,2 мкм, располагающихся отдельно, иногда парами, может в виде цепочек. Имеется выраженное капсулообразование, спор не образует, неподвижна. В начале роста вызывает легкое помутнение бульона, иногда с образованием пристеночного кольца. На 4-5 день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, при встряхивании пробирки поднимающийся в виде косички, при этом наблюдается просветление бульона. На сывороточном агаре данный микроорганизм образует колонии с ровными краями, сероватобелого цвета, диаметром 2-3 мм. На МПА растут в виде нежных мелких росинчатых колоний, слегка опалесцирующих в косопроходящем свете. Биохимические свойства. Штаммсеровариант А КМИЭВ-67 штамм-антиген - по биохимическим свойствам обладает способностью ферментировать глюкозу, галактозу, сахарозу, ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты без газа. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, на индол - положительная. Не продуцирует гемолизин и уреазу. Антигенный состав. Имеет в своем составе К- и О-антигены. Другие особенности и маркерные признаки. Штаммсеровариант А КМИЭВ-67 - штамм-антиген - в процессе роста образует гиалуроновую кислоту, которая может расщепляться гиалуронидазой, продуцируемой стафилококком. При взаимодействии с раствором акрифлавина в разведении 11000 штамм образует хлопьевидный осадок, разбивающийся при встряхивании. Условия хранения. Хранят в ампулах после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде в течение 5 лет при температуре 24 . Культивируют путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера, МПА на основе перевара Хоттингера - 1 раз в течение месяца. Антигенные свойства. Антигенная активность штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - в Г составляет 8 2. Иммуногенность. Иммуногенность штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - составляет 90 . Вирулентность. Штаммсеровариант А КМИЭВ-67 - штаммантиген обладает высокой вирулентностью, 50 которого составляет 0,3109 м.к. Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к следующим антибактериальным препаратам цефатоксиму, норфлоксацину, канамицину, цефалексину, пенициллину, энроксилу, гентамицину, амоксициллину, карбенициллину, рифампицину, доксициклину. 1. Пример выделения штаммасероварианта А КМИЭВ-67 штамма-антигена. Штаммсеровариант А КМИЭВ-67 - штамм-антиген - выделен при посеве кусочков легких на границе патологической и здоровой ткани на бульон Хоттингера. В первые сутки выращивания отмечали легкое равномерное помутнение среды,2 13085 1 2010.04.30 иногда образовывание пристеночного кольца. Через 7-10 дней хранения при температуре 24 на дне пробирки образовывался характерный слизистый осадок с полным просветлением бульона. 2. Пример определения ростовых свойств штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена. Ростовые свойства определяли в процессе культивирования по следующим параметрам максимальная удельная скорость роста и минимальное время генерации. Культивирование проводили глубинным методом во флаконах с бульоном Хоттингера с добавлением глюкозы при 37 С в течение 24 ч при постоянном перемешивании. Контроль за накоплением пастерелл проводили фотометрическим методом. Результаты исследований показали, что у штаммасероварианта А КМИЭВ-67 штамма-антигена - максимальная удельная скорость роста составила 1,73 л/ч, а минимальное время генерации 0,35 ч, что лучше, чем в описанном 1, максимальная удельная скорость роста которого составляет 1,45 л/ч, а минимальное время генерации 0,48 ч. 3. Пример определения химического состава штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена. Химический состав определяли следующим образом белок - по Лоури, углеводы 3,нуклеиновые кислоты 4. Для определения белка по Лоури к 0,4 мл антигенасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - добавили 4 мл реактива С, состоящего из 60 мл реактива А (2 -ный раствор 3 в 0,1 н растворе ) и 1 мл реактива В (0,5 -ный раствор 45 2 в 1 -ном растворе виннокислого натрия 2446). Смесь антигенасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - и реактива С выдерживали 10 мин при температуре 18-22 С, после чего добавили 0,2 мл реактива Фолина,встряхивали и через 30 мин определяли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 750 нм. В качестве контроля использовали физиологический раствор с добавлением реактива С и реактива Фолина. Для построения калибровочной кривой 10 г сывороточного альбумина растворяли в 100 мл дистиллированной воды, делали последующие двукратные разведения и в каждом определяли оптическую плотность белка, используя ранее указанные реактивы. Результаты исследования показаны в таблице. Химический состав культуры штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена Штаммсеровариант Химические компоненты Прототип А КМИЭВ-67 - штамм-антиген Белок, мг/мл 0,186 0,214 Углеводы, мг/мл 0,110 0,118 Нуклеиновые кислоты, мг/мл 0,07 0,09 4. Пример определения иммуногенной активности штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма антигена. Иммуногенную активность штаммасероварианта А КМИЭВ-67 штамма-антигена -изучали на щенках норки в возрасте 1,5-2 месяца (10 иммунизированных - опытных и 10 контрольных). Через 15 дней после иммунизации всем опытным животным и контрольным инъецировали предварительно подтитрованную дозу 50 бактериальной культуры штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что в опытной группе пало одно животное,клинических признаков заболевания не наблюдали. Следовательно, иммуногенная активность штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - составляет 90 , в то время как в прототипе она равна 80 . 3 13085 1 2010.04.30 5. Пример определения антигенной активности штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена. Антигенные свойства изучали в реакции непрямой гемагглютинации в разведении сыворотки до 1024. В качестве антигена использовали бактериальную культуру штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что антигенная активность штаммасероварианта А КМИЭВ-67 - штамма-антигена - составляет 8 2. Таким образом, штаммсеровариант А КМИЭВ-67 - штаммантиген, выделенный от пушных зверей, обладает наибольшим количественным содержанием белка - 0,214 мг/мл (у известного штамма 0,186 мг/мл), что влияет на повышение иммуногенной активности, высокими ростовыми свойствами с максимальной удельной скоростью роста 1,75 л/ч (у известного штамма 1,45 л/ч), более высокой иммуногенностью 90(у известного штамма 80 ) и антигенной активностью 8 2 (у известного штамма 7 2), что является важным в процессе формирования иммунного ответа и создания биопрепаратов, поэтому он может использоваться в качестве штамма-антигена. Источники информации 1. Каломнена Г.Ф., Антонова Н.И., Галибина Н.В., Лукьянова Е.Н., Семенютина Г.А.,Немчинов Н.Н., Рогожин С.П., Шегидевич Э.А. Физиологические и морфологические особенности пастерелл в процессе культивирования. Науч. основы пр-ва вет. препаратов. ., 1989. - С. 78-82. 2. Попова Т.Е., Шэгидевич Э.А., Клицунова Н.В. Характеристика поверхностных антигенов, выделенных методом водно-солевой экстракции // Биотехнология. - 2000. -4. - С 15-21 (прототип). 3. , . //. - 1956. - . 28. - Р.350-356. 4. Спирин А.С. Биохимия. - 1958. - . 23. - Вып. 5. - С. 656-662. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4