Штамм Pasteurella multocida серовариант D КМИЭВ-69 – штамм-антиген

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Бирман Борис Яковлевич Полоз Светлана Васильевна Андрусевич Андрей Сергеевич(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(56) КУЛИКОВА И.Л. и др. Ветеринария. 1995. -7. - . 25-28. СТРЕЛЬЧЕНЯ И.И. Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. - 2006. -2. - . 32-34. ЛЯХ Ю.Г. и др. Современные технологии сельскохозяйственного производства. Материалы конференции.международная научно-практическая конференция. - Гродно, 2007. - . 250251. ЛЯХ Ю.Г. и др. Витебская ордена Знак почета государственная академия ветеринарной медицины. Ученые записки учреждения образования, 2006. Т.42. Вып. 2. Ч.2. - . 145-147. ПОПОВА Т.Е. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1997. -3. - . 15-19. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается штамма, выделенного от пушных зверей больных пастереллезом, обладающего низкой токсичностью и предназначенного для конструирования лечебно-профилактических и диагностических препаратов при данном заболевании. Известен штаммсеровариант , обладающий недостаточным ростом при выращивании в синтетической среде 199, используемой для изготовления биопрепаратов, обладающей наименьшим количеством балластных веществ. При этом концентрация жизнеспособных популяций данного штамма составила 5,08108 в 1 мл. Биохимические свойства культур были типичны для пастерелл 1. Иммуногенность которого составляет 85 . Известен штаммсеровариант , токсическое действие капсульных антигенов высокое и составляет в разведении от 12 до 18 2. Однако эти известные штаммы обладают низкой концентрацией жизнеспособных клеток, высокой токсичностью капсульного антигена и низкой иммуногенностью. 13086 1 2010.04.30 Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение штамма, обладающего высокой концентрацией жизнеспособных клеток при культивировании в синтетической среде, низкой токсичностью капсульного антигена и высокой иммуногенностью для изготовления вакцины. Поставленная задача достигается тем, что штаммсеровариантКМИЭВ-69 - штамм-антиген. Выделен из легочной ткани больных пастереллезом пушных зверей в 2006 г. в Гродненском с/х отделении Гродненское зверохозяйство Гродненского района Гродненской области. ШтаммсеровариантКМИЭВ-69 - штамм-антиген- депонирован в коллекции микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. Коллекционный номер КМИЭВ - 69. Таксономическая принадлежность. Микроорганизм отнесен к видусеровариантсемейства . Патогенность для животных. ШтаммсеровариантКМИЭВ-69 штамм-антиген- патогенен для пушных зверей и лабораторных животных, при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г и молодняка норок. Культурально-морфологические признаки. Микроорганизм в фиксированных и окрашенных по Граму мазках имеет вид мелких грамотрицательных кокко-овоидов, размером 0,3-1,40,13-0,27 мкм, может располагаться одиночно, парами, иногда цепочками. Культура пастерелл неподвижная, имеет капсулу, спор не образует. На бульоне дает равномерное помутнение, при длительном хранении образует пристеночное кольцо и формирует феномен косички. На агаровых средах образует серовато-белые колонии с ровными краями, диаметром до 3 мм. Биохимические свойства. ШтаммсеровариантКМИЭВ-69 штамм-антиген- обладает способностью ферментировать глюкозу, галактозу, сахарозу,ксилозу, маннит и сорбит с образованием кислоты без газа. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная, на индол - положительная. Не продуцирует гемолизин и уреазу. Антигенный состав. Имеет в своем составе К- и О-антигены. Другие особенности и маркерные свойства. ШтаммсеровариантКМИЭВ-69 - штамм-антиген- дает положительную реакцию с раствором акрифлавина в разведении 11000, при этом образуется интенсивный хлопьевидный флоккулят, оседающий на дне пробирки и не разбивающийся при встряхивании. Способы и условия хранения. Хранят после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде в ампулах при температуре 2 - 4 С в течение 5 лет. Сохранность культур обеспечивается путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера,МПА на основе перевара Хоттингера 1 раз в течение месяца. Антигенные свойства. Антигенная активность штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма-антигена- в РНГА составляет 7 2. Иммуногенность. штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штаммаантигена- составляет 100 . Вирулентность. ШтаммсеровариантаКМИЭВ-69 - штаммантиген- обладает высокой вирулентностью, 50 которого составляет 1,34109 м.к. Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к антибактериальным препаратам энроксилу, норфлоксацину, цефатоксиму, цефалексину, гентамицину, канамицину,карбенициллину, рифампицину, пенициллину, доксициклину, окситетрациклину, амоксициллину, левомицетину. 1. Пример выделения штаммаКМИЭВ-69 - штамма-антигена. ШтаммКМИЭВ-69 - штамм-антиген- выделен при посеве кусочков легких на границе патологической и здоровой ткани на мясо-пептонный бульон с добавлением 0,2 мл аминопептида-2 на пробирку. В первые сутки выращивания отмечали лег 2 13086 1 2010.04.30 кое равномерное помутнение среды, иногда образование пристеночного кольца. Через 710 дней хранения при температуре 2 - 4 С на дне пробирки образовывался характерный слизистый осадок с полным просветлением бульона. 2. Пример культивирования штаммасеровариантаКМИЭВ-69 штамма-антигена. 18-часовую агаровую культуру данного штамма смывали с поверхности агара стерильным физиологическим раствором, доводили концентрацию бактериальной взвеси до 10 ед по оптическому стандарту мутности и вносили в среду 199 до конечной концентрации 1109 м.т. в 1 мл. Культивирование проводили в колбах объемом 500 мл,содержащих 150 мл среды, при постоянном перемешивании при температуре 37 С в течение 24 часов. Количество жизнеспособных клеток определяли методом титрования на сывороточном агаре Хиттингера. Результаты исследований показали, что концентрация жизнеспособных клеток популяции штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма-антигена- составила 7,21108 в 1 мл. 3. Пример определения токсичности капсульных антигенов штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма-антигена. В опыте использовали растворимые капсульные антигены штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штаммаантигена. Для этого суточную бульонную культуру засевали на 5 кровяной агар Хоттингера. Чашки Петри инкубировали при 37 С 18 часов, микробные клетки с поверхности агара смывали стерильным 2,5 -ным раствора хлорида натрия концентрацию доводили до 20 млрд.м.к. в 1 мл. Бактериальную взвесь экстрагировали на водяной бане 1 час при 56 С, затем дважды центрифугировали при 13000 об/мин в течение 20 мин супернатант собирали и подвергали диализу 48 часов против дистиллированной воды, содержащей раствор мертиолята натрия в конечной концентрации 110000. Для определения токсичности использовали культуру клеток ЛЭК (легкого эмбриона коровы). Суспензию клеток в концентрации 100 кл/мл вносили по 2 мл в пробирку (10 пробирок на каждое разведение) и культивировали при 37 С. После образования монослоя в пробирках меняли питательную среду и вносили препарат в разведениях 12, 14,18, 116, 132, 164. Результаты учитывали через 24-72 часа. Результаты исследований показали, что капсульные антигены-, полученные из штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма-антигена-, выращенного на агаре Хоттингера, разрушали 80 монослоя с образованием множества мертвых и округлых клеток в разведении 12. В разведении 14 отмечали 100 монослой с единичными округлыми клетками. В разведении 18 и далее 100 монослоя было без изменений морфологии клеток. 4. Пример определения иммуногенной активности штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма антигена. Иммуногенную активность штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма-антигена- изучали на щенках норки в возрасте 1,5-2 месяца (10 иммунизированных - опытных и 10 контрольных). Через 15 дней после иммунизации всем опытным животным и контрольным инъецировали предварительно подтитрованную дозу 50 бактериальную культуры штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма-антигена. Результаты реакции показали, что все опытные животные остались живы, клинических признаков заболевания не наблюдали. Следовательно, иммуногенная активность штаммасеровариантаКМИЭВ-69 - штамма-антигена- составляет 100 . Таким образом, штаммсеровариантКМИЭВ-69 - штаммантиген- обладает наибольшей концентрацией жизнеспособных клеток при культивировании в синтетической среде 199 и составляет 7,21108 в 1 мл, по сравнению и известным штаммом (5,08108 в 1 мл), и низкой токсичностью капсульных антигенов - разведение от 12-14 с разрушением от 80 монослоя до единичных клеток, по сравнению с известным штаммом (разведение 12-18 с 100-80 разрушения монослоя), и более высокой 3 13086 1 2010.04.30 иммуногенностью (100 ) по сравнению с известным штаммом (85 ), который может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов в качестве штамма - антигена. Источники информации 1. Попова Т.Е. Культурально-морфологические свойстваразличных серовариантов при культивировании в жидких питательных средах различного состава // Микробиология, эпидемиология и иммунология. - 1997. -3. - С. 15-19. 2. Куликова И.Л. Токсичность капсульных антигенов ./ И.Л. Куликова,Т.Е. Попова // Ветеринария. - 1995. -7. - С. 25-28 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4