Пептидный субстрат для определения активности эластазы в биологической жидкости

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПЕПТИДНЫЙ СУБСТРАТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭЛАСТАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Голубович Владимир Петрович Чемитова Лилия Михайловна Поликарпова Валентина Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Пептидный субстрат для определения активности эластазы в биологической жидкости общей формулы-3-2-1-,гдепредставляет собой защитную группуили остаток сукцината Р 3 представляет собойили 2 представляет собой остаток пролина 1 представляет собой остаток норвалинапредставляет собой остаток . Данное изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новым пептидным субстратам общей формулы -3-2-1-, гдепредставляет собой защитную группу В или остаток сукцината, 3 представляет собойили , 2 представляет собой остаток пролина, 1 представляет собой остаток норвалина,представляет собой остаток , которые могут быть использованы для определения эластолитической активности в различных биологических жидкостях. Протеолитический фермент эластаза участвует в развитии многих воспалительных процессов, таких как эмфизема, артриты, хронический бронхит, хронический и острый панкреатиты, новообразование (рак) поджелудочной железы и мн. др. 1. Известны синтетические пептидные субстраты эластазы общей формулы Х-Р 3-Р 2-1, гдеВо, , , Ас, имеющие в положении Р 1 остатки аланина или валина, а в положениях 3 и 2 - остатки аланина. Наиболее распространенными субстратами, используемыми в клинической практике, являются 2 и 3. Однако они не обладают достаточной активностью и специфичностью по отношению к эластазе. 11204 1 2008.10.30 Задачей данного изобретения является создание новых оригинальных пептидных субстратов с формулами и , содержащих в положении 1 норвалин, в положении 2 - пролин, в положении 3 глутаминовую кислоту, а в качестве ионогенных групп - остатки янтарной и глутаминовой кислот (соединение ), обладающих высокой активностью и специфичностью по отношению к протеолитическому ферменту эластазе, которые могут найти практическое применение в медицинской практике. Для решения данной задачи с помощью методов теоретического конформационного анализа разработаны структуры соединенийи ,обеспечивающие конформационное строение молекулы, необходимое для лучшего их связывания в активном центре эластазы. На основе проведенного конформационного анализа синтезированы оригинальные пептидные субстраты, которые проявляют повышенную по сравнению с соединениемактивность по отношению к эластазе, а также обладают большей специфичностью по отношению к данному ферменту. Схема синтеза субстратовивключает конденсацию -концевого дипептида с п-нитроанилидом С-концевой аминокислоты. Для синтеза дипептида ОМе к раствору Ро-ОМе в ДМФА прибавляют эквимолярное количество - и 1,1-кратный избыток . Перемешивание реакционной смеси проводят в течение 20 ч. При синтезе дипептида для защиты -карбоксила глутаминовой кислоты используют трет-бутиловый радикал. Использование этой защиты позволяет провести избирательный щелочной гидролиз С-концевого метоксикарбонила (к раствору в МеОН при комнатной температуре прибавляют 2 Н раствори перемешивают в течение 2 ч, после чего реакционную смесь подкисляют 10 раствором лимонной кислоты). Полученный защищенный дипептид используют для получения (к раствору - в ДМФА в присутствии -метилморфолина прибавляют последовательно эквимолярное количество , 1,05-кратный избыток НОВТ и при охлаждении 1,05-кратный избыток . Реакцию проводят в течение 21 ч). При деблокировании этого защищенного трипептида кислотным гидролизом (к суспензии в ЭА прибавляют 5 Н раствор НС 1 в ЭА и перемешивают в течение 1 ч) обе защитные группы удаляются одновременно. Сукцинилирование проводят в растворе хлористого метилена при использовании двухкратного избытка янтарного ангидрида. Разработанная схема синтеза позволяет получить целевые субстраты и с минимальным количеством стадий и выходом конечных продуктов 85 и 70 соответственно. Температуры плавления соединений определяют в открытых капиллярах. Упаривание растворов проводят на ротационном вакуумном испарителе при остаточном давлении 10-15 мм рт. ст. Однородность полученных соединений проверяют методом тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол с использованием следующих систем хлороформметаноламмиак (641), бутанолуксусная кислотаводаэтилацетат (3,5113,5). Активность и специфичность заявляемых пептидных субстратов подтверждена исследованиями эластолитической активности как на модельных образцах, так и в плазме крови больных с панкреатитом и пневмонией (примеры 1, 2 и 3). Пример 1. Кинетические исследования активности эластазы по отношению к пептидным субстратами . Исследования проводят на приборепри длине волны 410 нм. Используют водную суспензию эластазы фирмы . В опытную кювету вносят 2,7 мл буферного раствора Трис- (рН 8,5), 0,1 мл раствора эластазы, 0,2 мл раствора субстрата. В кювету сравнения перед внесением раствора субстрата добавляют 0,15 мл ледяной уксусной кислоты. Кюветы постоянно термостати 2 11204 1 2008.10.30 руют при 37 С. Прописывают кривую зависимости поглощения от времени при постоянной длине волны 410 нм. В результате исследований получают следующие кинетичекие характеристики соединений для /63483 -1 с-1, для /26724 -1 с-1, для Вос/1860 -1 с-1. По приведенным константам видно, что активность эластазы по отношению к оригинальным пептидным субстратамивыше по сравнению с известным пептидным субстратом . Пример 2. Определение активности эластазы в плазме крови больных с панкреатитом и пневмонией с помощью пептидного субстрата . Исследуют плазму крови пациентов с острым деструктивным панкреатитом и пневмонией. Плазму крови больных получают путем центрифугирования при 3000 об./мин. Определение эластолитической активности проводят по методике Веремеенко и соавт. 4. Контрольные исследования осуществляют с помощью синтетического субстрата (П) фирмы . Оптическую плотность исследуемых образцов определяют против холостых на спектрофотометре СФ 26 при длине волны 410 нм. В опытную пробу вносят 0,1 мл плазмы крови, 2,7 мл 0,1 М буферного раствора Трис рН 8,0 и 0,1 мл (С 4 мг/мл). Смесь инкубируют в течение 4 ч при 37 С, после чего добавляют 0,1 мл ледяной уксусной кислоты. В холостую пробу уксусную кислоту вносят перед субстратом. Опытные и холостые пробы центрифугируют 30 мин при 5000 об./мин. Надосадочную жидкость сливают и определяют оптическую плотность опытных проб против холостых при 410 нм. Количество образовавшегося п-нитроанилина, эквивалентное количеству расщепленного , определяют по калибровочному графику. Для его построения на оси абсцисс откладывают различные концентрации п-нитроанилина (0,02-0,24 мкмоль/л), на оси ординат - оптическую плотность соответствующих растворов (п-нитроанилин растворяют в дистиллированной воде). Их измеряют против дистиллированной воды при длине волны 410 нм. Пример расчета. Оптическая плотность пробы равна 0,07. По калибровочной кривой это соответствует 0,02 мкмоль/л п-нитроанилина. Расчет проводится по формуле 0,02 100050 мкмоль /( чл ),0,14 где 0,02 - количество образовавшегося п-нитроанилина (мкмоль/л) 1000 - коэффициент для пересчета на 1 л плазмы крови 0,1 мл - количество плазмы в пробе 4 - длительность инкубации (ч). По результатам исследований эластолитической активности в плазме крови пациентов с пневмонией и острым деструктивным панкреатитом с помощью синтезированного нами оригинального пептидного субстрата и стандартного субстратафирмыпоказывает наличие достаточно тесной корреляции в изучаемых группах. Пример 3. Исследование специфичности полученных субстратовипо отношению к эластазе в сравнении с известным субстратом . Исследования проводят на спектрофотометре СФ 26 при длине волны 410 нм. В работе используют образцы трипсина (ЕС 3.4.21.4), -химотрипсина (ЕС 3.4.21.1),пепсина (ЕС 3.4.23.1) фирмы , папаина (ЕС 3.4.22.2) фирмы , субтилизина Вас.(ЕС 3.4.21.62), металлопротеиназы Вас.( 3.4.24.4) Диагностикум,Москва. В опытную кювету вносят 2,7 мл буферного раствора Трис- (рН 7,4), 0,1 мл раствора фермента (С 0,003 мг/мл), 0,2 мл раствора субстрата (С 0,13 мг/мл). В кювету сравне 3 11204 1 2008.10.30 ния перед внесением раствора субстрата добавляют 0,15 мл ледяной уксусной кислоты. Реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 3 ч, при 25 С - в течение 21 ч. Результаты исследований специфичности заявляемых соединенийипо отношению к эластазе в сравнении с известным субстратомприведены в таблице. Исследуемые соединения,Металэксп.,СубтиС Трипсин Папаин лопро- Пепсин час лизин химотрипсин теин 37 3 0 0,095 0 0,120 0 0.015 25 18 0,015 0,250 0,020 0,380 0,010 0,020 37 3 0 0,200 0 1,000 0 0 25 18 0 0,400 0 1,200 0 0 37 3 0,035 0,040 0,050 0,250 0,015 0,025 25 18 0,065 0,060 0,085 0,315 0,065 0,050 По результатам исследований активности пула протеиназ к пептидным субстратам специфичность по отношению к эластазе убывает в ряду . Источники информации 1..// . . . - 1985. - . 36. - . 207-216. 2..,-// .. . . - 1973. - . 53. -2. - . 383-386. 3..,В.,//. - 1974. -11. - . 350-357. 4. Веремеенко К.Н., Кизим А.И., Терентьев А.Г. Определение эластазы и ее ингибиторов в сыворотке крови с помощью хромогенных субстратов // Клин.-лаб. диагностика. 1992. -5-6. - С. 58-61. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4