Способ определения поливалентного антигена в биологической жидкости

/ Изобретение касается усовершенствованного способа определения иммунологически связываемого поливалентного вещества в присутствии по меньшей мере двух специфических для иммунологичесни связываемого вещества реактивов и в присутствии ингибитора для компенсации вредных факторов в пробах сыворотки крови человека, а также пригодного для этого реактива. ЙЧдгвствительное определение имьлунологически связываемых ве-д шеств, как, например, поливалентных антигенов (пептиды, протеины,полисахариды, вирусы, бактерии, специфические клетки) при использовании двух или при необходимости большего количества антител,которые направлены против пространственно различных антигенных детерминатов, известно в виде иммунорадиометрического или иммуноэнзимометрического слоистого анализа (иммуноанализ с двумя участ ками). Наиболее употребительной является реализация зтого извест ного способа определения, причем определяемый антиген (проба) инкубируется с помощью первого антитела, которое или в твердой фе- ее соединено с пригоднм материалом-носителем, как, например, сефароза агароза трубочки из синтетического полимера и тому подоб ное, или имется гомогенно как, например, битинилированно В растворе, и с помощью определенного количества второго или других маркированных антител в жидкой фазе. Специфичность второго и при необходимости других антител выбирается предпочтительно таким образом, что она направлена против других детерминатов определяемого антигена как первое антитело, чтобы исключить конкурентнуюборьбу между антителами за те же самые места присоединения к оп гопределяемому антигену так как этим была бы снижена чувствительность пробы. Как первое, соединенное в твердой фазе или биотинилированное, так и второе или другое, имеющееся в растворе маркироп ванное антитело добавляются в избытке. Соответствующий антиген может определяться или через зафиксированную на первом антителе или оставшуюся в растворе, имунологически несвяую активность. В Пос леднем случае необходимо добавлять определенное количество маркиро ванных вторых антител.По причине необходимой специфичности для иммунологических сло истых анализов используются, в частности, выведенные из моноклональ ныл антител (МАК) совершенные иммуноглобулины 19 Били 4 ммунологича кн реактивные фрагменты (РаЬ, Р(аБ)2). Однако кроме того в эти прот бы можно вводить иммунореактивные составные части, которые выводятон из полиилональных антител (РАН).Хотя в описанных иммуноаналивах с двумя участками для опреде-г лнемых аналитов используются специфические антитела, со значителЬ ной частотой появляются пробы сыворотки крови человека, которые вызывают неспецифические реакции. Последние приводят к ошибочным результатам испытаний с соответственно отягащающими последствиями для терапевтических мероприятий. Появление неспецифических реакций можно объяснить имеющимися в пробе веществами, которые точно также,как и определяемый аналит (поливалентный антиген), связывают специфические иммуноглобулиновые реагенты(вредные факторы), однако в других точках воздействия.Поэтому обычно к таким иммуноанализам превентивно В избытке добавляются неспецифические имуноглобулины или фрагменты иммуно пцглобулинов (как правило, речь при этом идет об иммуноглобулине ь, Т С) тек же видов животных, от которых происходят специфическиеантитела (СЩЪЙФЙУЙ/д д Йедшд ИДшддЙИЙ/Й/Ж Егйвйж/тлуйлжу джаза Лклзт - 147 (1974) европейский патент Ю 0174026). С момента применения специфических монокло нальных антител, которые как правило, происходят от мыши, указанное мероприятие по устранению помех в иммуноанализах требует большого количества неспецифического мшиного иммуноглобулина 190-в форме мышиной сыворртки, мышиного асцита или изолированного мышиного иммуноглобулина (примерно 300 500 мкг мл 0164. СЙИП 1 1491 1495 (1986) ). Например, в соответствии с европейским патен-Ч том в 0174026 благодаря добавка примерно 30 мкг/мл важного неспецифического мышиного или крысиного иммуноглобулина 139 к иммунопробам описанного типа только в определенных сыворотках и в особых случаях (отрицательных пробах) достигается полная компенсация нарушений. Однако приготовление мышиного иммуноглобулина в масштабе порядка килограммов невозможно при существующих сегодня методах в экономически интересных условиях и к тому же вызывает критику с этических точек зрения.Важным мероприятием для избежания помех в иммунопробах указанного типа является применение РаЬ или Р(а )2 фрагментов по меньшей мере для одного из примененных в иммунопробе специфических антител. Тем самм все вредные факторы в пробе, которые направлены на Рсчасти иммуноглобулина 10 (ревматические факторы, антиРс иммуноглобулины, как например, 13 М) устраняются в точке его воз действия на одном из специфических реагентов и таким образом не нуждаются в компенсации.Однако несмотря на использованные специфические реагенты антител, свободные от фрагментов Рс, в некоторых сыворотках крови4 человека в иммунопробах появляются нарушения. Эти нарушения можно объяснить наличием в сыворотке субстанций, которые направлены на фрагменты РаЕили Р(а)2. В соответствии с европейским патентом Ю 0083869 такие вредные факторы зоны РаЬ распознаются только тогда, когда они отделены от Рс части. В соответствующих иммунопро бах эти факторы могут быть устранены путем добавки нативных или сетчатых, неспецифических для определяемого антигена фрагментов Ра 1 или Р(а)2 (европейский патент ф 0083869). При этом агрегированные фрагменты РаЬ или Р(а 32 обнаруживают в 2-3 раза более высокое защитное действие по сравнению с нативными составными частями. Напротив, полные неспецифические имуноглобулины 196 в соответствии с европейским патентом Ш 0083869 не способствуют защите от вредных факторов в указанных иммунопробах как в нативной так и в агрегированной форме. Кроме того, способ имеет существенный недостаток, заключающийся в том, что при этом наряду со специфическими для определяемого антигена иммуноглобулиновыми реагентами требуется значительное количество высококачественных неспецифических иммуноглобулиновых реагентов, что привносит с собой существенные экономические, а также этические проблем. В соответствии с этим для защиты от вредных факторов используются, например, по меньшей мере в количестве 1 ООмкг/мл, оказавшиеся эффективными агрегированные неспецифические фрагменты иммуноглобулина, свободные от фрагмента Рс. Поэтому в основе изобретения лежит задача предоставления в распоряжение новых возможностей для компенсации неспецифических реакций при иммуноанализах с помощью содержащих Рс - фрагменты и свободных от РС- фрагментов специфических реагентов антител в качестве специфических реактантов благодаря чему в сыворотках кровичеловека надежно устраняются направленные на полные иммуноглобули