Способ получения ферритина

(73) Патентообладатели Стрельченок Олег Анатольевич, Дрожденюк Анатолий Павлович,Усанов Сергей Александрович, Лобанов Николай Александрович(57) Способ получения ферритина, включающий получение тканевого экстракта, фракционирование его сульфатом аммония и адсорбционную хроматографию, отличающийся тем, что экстракцию проводят в присутствии ингибитора протеаз, перед фракционированием осуществляют термообработку тканевого экстракта, а хроматографию проводят непосредственно после фракционирования. Изобретение относится к области биологической и медицинской химии, конкретно к способу получения ферритина из селезенки и сердца человека. Ферритин (Ф) - крупный субъединичный белок, состоящий из двух типов субъединиц тяжелой (Н) и легкой . Н-субъединицы преобладают в составе кислых Ф, характерных для сердца, плаценты, красных кровяных клеток, лимфоцитов и моноцитов, в то время как Ф селезенки и печени обогащен -субъединицами основного характера. Небольшое количество ферритина присутствует в плазме крови человека и изменение его уровня позволяет рассматривать этот белок в качестве специфического маркера состояния человеческого организма. В связи с этим разработаны и внедрены в медицинскую практику радиодиагностические тест-системы для исследования такого рода заболеваний. Основным компонентом данных систем является высокоочищенный препарат Ф. Начальной стадией выделения Ф является, как правило, термообработка (70-80 С, 5-10 мин) гомогената того или иного органа, так как было установлено, что данный белок является термостабильным, в то время как часть других белков денатурирует и коагулирует 1.После центрифугирования и отде 4903 1 ления осадка супернатант, содержащий Ф и другие термостабильные белки, подвергают дальнейшему фракционированию и хроматографической очистке. Известен способ получения Ф из селезенки или печени человека 2, заключающийся в том, что тканевый экстракт подвергают термообработке, фракционируют сульфатом аммония, белки с низкой скоростью седиментации удаляют ультрацентрифугированием, а конечную очистку целевого продукта проводят гель-хроматографией на Сефадексе 200 и кристаллизуют белок из раствора сульфата кадмия. Известен способ 3 получения Ф, включающий получение тканевого экстракта печени, термообработку,улътрафильтрацию (ХМ-300), гель-хроматографию на Сефакриле -300, аффинную хроматографию на. Выход ферритина - 32 . Наиболее близким к заявляемому является способ 4 получения Ф, заключающийся в получении тканевого экстракта, фракционировании его сульфатом аммония, ультрацентрифугировании и гельхроматографии. Для повышения выхода целевого продукта проводят хроматографию на кальций-тартратном геле. Задачей настоящего изобретения является упрощение технологии получения высокоочищенного Ф (9598 чистоты) и увеличение его выхода. Поставленная задача достигается заявляемым способом получения высокоочищенного Ф в препаративных количествах, включающем получение тканевого экстракта, термообработку экстракта, фракционирование его сульфатом аммония и адсорбционную хроматографию. Высокая степень чистоты препарата ферритина из сердца человека подтверждается методом электрофореза в 15 ПААГ (фиг. 1). На электрофореграмме отчетливо проявляются только тяжелые и легкие субъединицы ферритина. Пример 1. Получение Ф из селезенки человека. Постмортальную быстрозамороженную ткань селезенки измельчают и гомогенизируют в дистиллированной воде в соотношении препарат Н 2 О (13) в течение 5 мин с добавлением ингибитора протеаздо конечной концентрации 0,001 М. Полученный гомогенат перемешивают в течение 2 ч для более полной экстракции Ф. Затем осадок отделяют центрифугированием (16-15 тыс. об/мин), а супернатант подвергают термообработке (70 С, 3 мин) в термостатированном стакане. После термообработки коагулированные белки удаляют центрифугированием (15000 об/мин, 20 мин). Фракционирование сульфатом аммония (СА). В супернатант добавляют СА до 35 насыщения, осадок отбрасывают, в супернатант добавляют СА до 58 насыщения, инкубируют 1 час при 40 С и супернатант отбрасывают. Хроматография на кальций-тартратном геле (КТГ). Колонку, заполненную КТГ, уравновешивают натрий-фосфатным буфером (НФБ), содержащим мочевину и бикарбонат натрия, рН 8,0 и наносят сульфат-аммонийный осадок белков, растворенных в этом же буфере. В данных условиях большинство белков не связывается с сорбентом. После нанесения колонку промывают 0,1 М НФБ, а Ф элюируют 0,25 М НФБ, добавляют СА до 70 насыщения и хранят при 4 С в течение 1 месяца или пропускают раствор через бактерицидные фильтры и хранят в растворе. Пример 2. Исключение стадии тепловой обработки. После получения тканевого экстракта было проведено фракционирование белков сульфатом аммония (35 и 58 насыщения), а дальнейшая очистка включала хроматографию на КТГ (аналогично примеру 1) и дополнительную очистку методом гель-хроматографии на Сефадексе -200. Препараты Ф, полученные по примерам 1 и 2, показали идентичность иммунохимических свойств в иммунорадиометрической системе ИРМО-ферритин производства ХОП ИБОХ НАН Б. Кроме того прогрев препарата Ф(70 С, 3 мин), полученного по примеру 2, не привел к изменению его иммунных свойств. Таким образом, первоначальная термообработка экстракта не приводит к изменению нативной структуры Ф при условии добавления ингибитора протеаз в буферные системы выделения. Пример 3. Выделение Ф из сердца человека. Процесс осуществляли, как описано в примере 1. Отличием является использование при десорбции белка с КТГ 0,2 М НФБ, рН 7, 4. Выход белка, полученного по способу 4 (прототип), составляет 10-12 мг белка из 100 г ткани печени и 15-19 мг из 100 г ткани селезенки человека. В связи с тем, в заявляемом способе отсутствуют стадии ультрацентрифугирования и гель-фильтрации, значительно усложняющие процедуру выделения и приводящие к 2 4903 1 существенной потере белка, выход ферритина по заявляемому способу составляет 18-26 мг из 100 г ткани селезенки и 6-10 мг из 100 г ткани сердца человека. Некоторые отличия в выходе очищенных препаратов из 100 г ткани связаны с разным содержанием ферритина в исходной ткани, используемой для выделения и очистки белка. Выделение ферритина из ткани печени не проводилось. Важным преимуществом от способа-прототипа наряду с исключением двукратного ультрацентрифугирования является использование в процессе адсорбционной хроматографии специальной буферной системы,которая препятствует связыванию с сорбентом балластных белков, а также предотвращает белок белковое взаимодействие, что приводит, в конечном счете, к двухстадийному получению Ф высокой степени чистоты. Источники информации Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 3