Способ выделения ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНКИЛИ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Бадыгина Наталья Александровна Костюк Светлана Андреевна Полещук Николай Николаевич Рубаник Лариса Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(57) Способ выделения ДНКили, включающий лизирование бактерий, осаждение и ресорбцию ДНК, отличающийся тем, что лизис бактерий проводят гуанидин тиоционатом, осаждают ДНК на частицах силикагеля, а после ресорбции ДНК дополнительно проводят ее очистку и концентрирование путем обработки сначала изопропанолом, а затем 70 этанолом. Изобретение относится к области медицины, а именно к способам выделения ДНКилииз жидкой культуральной среды. Известен способ выделения ДНК из культурыилис использованием фенольно-хлороформного метода, включающего ферментативный протеолиз с последующими депротеинизацией и осаждением ДНК 1. Недостатком этого способа является использование в работе таких агрессивных веществ, как фенол и хлороформ. Разработанный способ выделения ДНКилипозволяет получить из жидкой культуральной среды очищенную и концентрированную ДНК ( 20 мкг/мл), необходимую для дальнейших фундаментальных или аналитических исследований, создания калибратора с известной концентрацией ДНКили. Задачей заявленного способа является получение высококонцентрированной и очищенной ДНКили, выделенной из жидкой культуральной среды. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ выделения ДНКи,включающий лизирование бактерий, осаждение и ресорбцию ДНК, причем лизис бактерий проводят гуанидин тиоционатом, осаждают ДНК на частицах силикагеля, а после ресорбции ДНК дополнительно проводят ее очистку и концентрирование путем обработки сначала изопропанолом, а затем 70 этанолом. 11321 1 2008.12.30 Из культуры микроорганизмов ДНК выделялась сорбционным методом. При этом к 100 мкл жидкой культуральной среды, в пробирке объемом 1,5 мл, добавляли 300 мкл лизирующего раствора, содержащего гуанидин тиоционат. Пробы тщательно перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 5 мин при 65 С. Пробы центрифугировали в течение 5 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость использовали для выделения ДНК,перенеся в новую пробирку. Тщательно ресуспензировали сорбент (на частицы силикагеля) на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавляли по 20 мкл ресуспензированного сорбента. Перемешивали на вортексе каждую пробирку, инкубировали при комнатной температуре 2 мин, затем еще раз перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 5 мин. Осаждали сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс. об/мин в течение 30 с. Удаляли супернатант, используя отдельный наконечник для каждой пробы и вакуумный аспиратор в колбу-ловушку. К осадку добавляли по 500 мкл раствора для отмывки, перемешивали на вортексе до полного ресуспензирования сорбента. Центрифугировали пробы 30 с при 10 тыс. об/мин на микроцентрифуге. Удаляли супернатант, используя отдельный наконечник для каждой пробы и вакуумный аспиратор в колбу-ловушку. Отмывку повторяли еще раз и удаляли супернатант. Пробирки помещали в твердотельный микротермостат и подсушивали пробы 5-10 мин при температуре 65 С,оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляли 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, перемешивали на вортексе и инкубировали в течение 5 мин при 65 С, периодически встряхивая на вортексе. Пробирки центрифугировали в течение 1 мин при 12 тыс. об/мин на микроцентрифуге, супернатант переносили в чистую пробирку. После чего дополнительно проводят осаждение ДНК путем добавления к 100 мкл супернатанта 100 мкл изопропанола и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем центрифугировали при 1200015 мин. Супернатант тщательно удаляли. ДНК дополнительно очищали путем добавления к осадку 1 мл 70 -го этанола, затем перемешивали на вортексе. Центрифугировали пробы 30 с при 10 тыс. об/мин. Супернатант удаляли, осадок высушивали в течение 5 мин и элюировали в 50 мкл ТЕ-буфера. Пример расчета. Из жидкой культуральной среды (, Франция), содержащей, предлагаемым способом была выделена ДНКв концентрации 29,05 мкг/мл. Измерение концентрации ДНКпроводилось спектрофотомером при длине волны 260 нм соотношение А 260/А 280 составило 1,8, а А 320 0,02. Данные показатели свидетельствуют о достаточной очистке и концентрировании раствора ДНК. При этом без дополнительных этапов осаждения ДНК изопропиловым спиртом, очистки 70 этанолом и элюции ДНК в 50 мкл ТЕ-буфера концентрация ДНК составила 17,3 мкг/мл, соотношение А 260/А 2801,2, а А 320 - 0,28, что свидетельствует о недостаточной концентрации и чистоте полученного препарата ДНК. Таким образом, по сравнению с прототипом заявленный способ позволяет получить следующие преимущества выделить очищенную и концентрированную геномную ДНКилииз жидкой культуральной среды, что необходимо для создания стандартного положительного образца с известной концентрацией, расширения диапазона фундаментальных исследований уникального нуклеинового материала из жидкой культуральной среды. Источники информации 1.. ,,,//. 1998. . 36, . 10. . 3032-3039. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.