Способ молекулярно-генетической диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ УСТОЙЧИВОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА К РИФАМПИЦИНУ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр пульмонологии и фтизиатрии(72) Авторы Слизень Вероника Вячеславовна Суркова Лариса Константиновна Залуцкая Оксана Михайловна Титов Леонид Петрович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр пульмонологии и фтизиатрии(56)2204608 2, 2003.2287586 2, 2006.2263149 2, 2005.2175015 1, 2001. Суркова Л.К. и др. Современные проблемы инфекционной патологии человека Сб. научн. трудов. Вып. 1. Минск, 2008. - С.235-238. Организация определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза. Инструкция по применению. Регистрационный 107-1102 от 30 декабря 2002 г. Современные методы диагностики, лечения и профилактики заболеваний Сб. инструктивнометодических документов. Т. 4. Вып. 3. Минск, 2003. - С. 169-186.(57) Способ молекулярно-генетической диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину, при котором выделяют ДНК микобактерий туберкулеза из образца диагностического материала больного, с помощью ПЦР в реальном времени проводят амплификацию фрагмента генамикобактерий длиной 81 п. о., кодирующего-субъединицу РНК-полимеразы, используя прямой 53 и обратный 53 праймеры, и одновременно выявляют отсутствие или наличие мутаций в кодонах 516 и/или 526, и/или 531 гена , определяющих устойчивость микобактерий туберкулеза к рифампицину, с использованием в соответствии с таблицей 1 описанияпроб, меченных 1, комплементарных кодонам 516, 526 и 531 генадикого типа, ипроб, меченных 1, комплементарных мутантным кодонам 516, 526 и 531 гена , и диагностируют наличие устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину при регистрации флуоресценциипробы на длине волныи отсутствии флуоресценции на длине волныили диагностируют отсутствие устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину при регистрации флуоресценциипробы на длине волныи отсутствии флуоресценции на длине волны . 16610 1 2012.12.30 Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к фтизиатрии,и может быть использовано для экспресс-диагностики туберкулеза с лекарственной устойчивостью. Обоснование актуальности разработки. Распространение лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ) является одной из наиболее серьезных проблем борьбы с туберкулезом. Напряженность эпидемической ситуации по туберкулезу во всем мире, в том числе и в Республике Беларусь, в последние годы обусловлена ростом числа больных, инфицированных множественно лекарственно-устойчивыми (МЛУ) штаммами МБТ, то есть штаммами с устойчивостью к рифампицинуи изониазиду. В последние годы в республике отмечается рост туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью. В 2008 году удельный вес первичной множественной лекарственной устойчивости среди вновь выявленных больных с бактериовыделением составил 15,7 , а среди контингентов бактериовыделителей достиг 46,8 . Лечение туберкулеза с МЛУ требует длительного (до 24 месяцев) применения дорогостоящих химиопрепаратов,длительной госпитализации и нередко остается неэффективным, обусловливая высокий удельный вес инвалидизации и смертности. Выявление устойчивости к рифампицину может быть использовано в качестве маркера множественной резистентности микобактерий,поскольку, в соответствии с данными литературы, резистентность к рифампицину у 8090 штаммов МБТ коррелирует с устойчивостью к изониазиду. В настоящее время основными и наиболее доступными для практического применения являются микробиологические методы определения лекарственной чувствительности МБТ. Определение спектра резистентности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным лекарственным средствам (ПТЛС) с использованием этих методов занимает до 3 месяцев, что обусловливает ретроспективный характер получаемых результатов. Альтернативным и более перспективным вариантом решения этой проблемы является использование молекулярно-генетических методов, основанных на определении точечных мутаций или других генетических маркеров резистентности микобактерий к ПТЛС. В последние годы в практику фтизиатрии внедряются молекулярно-биологические методы диагностики, в частности с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, которые существенно снижают время детекции возбудителя и существенно повышают чувствительность исследования. Благодаря расшифровке генома МБТ стали известны гены, продукты которых являются мишенями для действия различных ПТЛС, а возникновение мутаций в этих генах приводит к резистентности к этим лекарственным средствам. Наиболее близким к заявляемому является способ диагностики чувствительности штаммов МБТ к изониазиду, основанный на выявлении мутаций в генах , / иметодом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов 1. Недостатком прототипа является невозможность детекции множественной лекарственной устойчивости МБТ. Задачей настоящего изобретения является разработка способа молекулярногенетической диагностики устойчивости к рифампицину у микобактерий туберкулеза, что является маркером множественной лекарственной устойчивости МБТ. Поставленная задача решается предлагаемым способом молекулярно-генетической диагностики туберкулеза и устойчивости к рифампицину и включает выделение ДНК из образцов диагностического материала, проведение ПЦР с целью выявления мутаций в гене роВ, кодирующем -субъединицу РНК-полимеразы. Выявление точечных мутаций проводят в участке роВ гена размером в 81 п.о., при этом исследование образцов на присутствие наиболее часто встречающихся мутаций в кодонах 516, 526, 531 проводят с помощьюзондов с использованием системы двойного распознавания, что предполагает применение для поиска мутаций в одном кодоне зондов двух типов 1) комплементарных немутантным (диким) последовательностям ДНК микобактерий 2) комплементарных мутантным последовательностям ДНК микобактерий. 2 16610 1 2012.12.30 Способ осуществляют следующим образом. Способ заключается в исследовании образцов диагностического материала или чистых культур на присутствие в ДНК микобактерий мутаций в кодонах 516, 526, 531, ассоциированных с резистентностью к рифампицину, с использованиемзондов. Принцип работызондов. В основу работызондов положен резонасный перенос энергии флюоресценции .зонды содержат две метки-красителя на 5 конце зонда - меткудонор (например,(6-карбоксифлюоресцеин) или(2,7-диметокси-4,5-дихлоро-6 карбоксифлюоресцеин), на 3 конце зонда - метку-акцептор ((-1. Близость донора и акцептора в свободномзонде приводит к гашению флюоресценции за счет . В случае использования данного способа детекции мутаций вгене .флюоресценцию регистрируют, когда нуклеотидный состав зонда полностью соответствует искомой ДНК, и он полностью связывается с последовательностью-мишенью. В случае полного комплементарного связывания зонда и ДНК-матрицы происходит присоединение -полимеразы к 5-концу зонда. -полимераза проявляет экзонуклеазную активность и отщепляет флуоресцирующую метку от зонда, что сопровождается появлением флуоресцентного сигнала, определяемого прибором ПЦР в реальном времени на длине волны отщепленного флюорофора. Регистрируя интенсивность свечения, исследователь может узнать о ходе реакции без дополнительной стадии - электрофореза. Существенным преимуществом является то, что регистрация флуоресценции происходит в закрытой пробирке, что полностью исключает контаминацию продуктами ПЦР. Оборудование и расходные материалы. Проведение исследований с помощью данного способа требует наличия следующего оборудования и расходных материалов тест-штаммы микобактерий туберкулеза, полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасевича и Национальной коллекции музейных штаммов амплификатор в реальном времени центрифуга на 14000 об/мин. шейкер 250-3000 об/мин весы аналитические точностью 0,01-0,1 мг ламинарный шкафкласса безопасности УФ-лампа, автоклав, пробирки пластмассовые микроцентрифужные объема 1,5 и 0,6 мл вытяжной шкаф спирт этиловый 96 и 70 одноразовые перчатки без талька наконечники одноразовые пластиковые объемом 0,5-250, 200-1000 мкл с аэрозольным барьером и без него дозаторы переменного объема на 0,5-10, 5-50, 20-200, 200-1000 мкл вода для инъекций либо стерильная бидистиллированная вода без нуклеазы. Последовательность проведения исследований. Данный способ предполагает проведение следующих этапов взятие пробы диагностического материала выделение ДНК из микобактерий туберкулеза (чистых культур или находящихся в биологическом материале) стандартным методом проведение реакции ПЦР в реальном времени - амплификации фрагментов роВ гена микобактерий туберкулеза с одновременной гибридизацией с флюоресцирующими зондами анализ флюоресценции с помощью прибора ПЦР в реальном времени и интерпретация результатов. 3 16610 1 2012.12.30 Принцип метода. 1. Если в образце присутствует ДНК микобактерий с мутациями в одном из кодонов 516, 526, 531 а)зонды мутантного типа к 516, 526, 531 кодонам, меченные , присоединяются к комплементарной им последовательности ДНК. Благодаря экзонуклеазной активности -полимеразы происходит отщепление флуоресцирующей метки от зонда,что сопровождается появлением флуоресцентного сигнала, определяемого прибором ПЦР в реальном времени на длине волны(возбуждение - 520 нм, экстинкция - 548 нм). б)зонды дикого типа к 516, 526, 531 кодонам, меченные АМ, не присоединяются к ДНК, и -полимераза не отщепляет флуоресцентную метку, флуоресцентный сигнал при этом отсутствует на канале для АМ (возбуждение - 492 нм, экстинкция 517 нм). 2. Если в образце отсутствует ДНК микобактерий с мутациями в одном из кодонов 516, 526, 531 а)зонды мутантного типа к 516, 526, 531 кодонам, меченные , не присоединяются к ДНК, и -полимераза не отщепляет флуоресцентную метку, флуоресцентный сигнал при этом отсутствует на канале для(возбуждение - 520 нм, экстинкция 548 нм). б)зонды дикого типа к 516, 526, 531 кодонам, меченные АМ, присоединяются на участке между прямым и обратным праймерами, -полимераза отщепляет АМ от зонда, что сопровождается появлением флуоресцентного сигнала, определяемого прибором ПЦР в реальном времени на длине волны на канале для АМ (возбуждение 492 нм, экстинкция - 517 нм). Таким образом, в пробах с М. , имеющих мутации в одном из кодонов 516,526, 531, флюоресцирует -зонд, специфичный соответствующему кодону, в то время как -зонд к дикому типу кодонов не флюоресцирует. В пробах с М. , не имеющих мутаций в одном из кодонов 516, 526, 531,флюоресцирует -зонд, специфичный соответствующему дикому типу кодона, в то время как -зонд к мутантному типу не флюоресцирует. Состав праймеров и зондов. Для осуществления способа молекулярно-генетической диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину с использованием двойных флюоресцирующих зондов в каждый образец реакционной смеси должны быть внесены два праймера (прямой и обратный) и два зонда, один из которых специфичен мутантному типу кодона, а другой специфически взаимодействует с диким (немутированным) типом кодона. Так как устойчивость к рифампицину связана преимущественно с присутствием единичных мутаций в одном из кодонов 516, 526, 531 (или одновременным присутствием двойных или тройных мутаций в указанных кодонах), то для каждой изучаемой пробы ДНК М.проводится одновременное определение мутаций в трех кодонах 516, 526, 531. Определение мутаций в трех кодонах (516, 526, 531) проводится независимо в трех различных реакционных пробирках, содержащих три разные реакционные смеси. Последовательность праймеров и зондов для осуществления способа молекулярно-генетической диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину с использованием двойных флюоресцирующих зондов приведена в табл. 1. 16610 1 2012.12.30 Таблица 1 Праймеры и зонды, необходимые для амплификациигена и выявления в нем мутаций в 516, 526, 531 кодонах ФлюорофорФлюорофорПраймеры Тип Олигонуклеотид 53 акцептор, 3 донор, 5-конец конец Праймеры для амплификациипрямой-1 Приготовление реакционной ПЦР-смеси. Для осуществления способа молекулярногенетической диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину с использованием двойных флюоресцирующих зондов готовят для каждой пробы ДНК в трех разных пробирках три реакционные смеси для 516, 526 и 531 кодонов. Состав реакционных смесей оптимизирован таким образом, чтобы использованные праймеры и зонды обеспечивали высокую чувствительность реакции. Следует отметить, что важным аспектом реакционной смеси является соотношение концентраций праймеров один из праймеров взят в избыточном количестве, таким образом, ПЦР приобретает асимметричный характер, что приводит к накоплению одной из нитей ДНК в большем количестве. Следует соблюдать равенство концентраций зондов в реакционных смесях для 516, 526 и 531 кодонов. В процессе проведения ПЦР необходимо предусмотреть положительные контрольные образцы (реакция проводится с МБТ с мутациями), отрицательные контрольные образцы (реакция проводится с МБТ без мутаций), фон (реакция проводится с 1 ТЕ буфером вместо внесения образцов ДНК микобактерий). Состав реакционной смеси приведен в табл. 2. В реакционную смесь для выявления мутаций в 531 кодон не вносят раствор бетаина, вместо него вносят равный объем воды. Таблица 2 Состав реакционных смесей для проведения ПЦР в реальном времени из расчета на 1 реакцию Вносимое количество из расчета на одну реакцию, проводиРеагент мую в реакционном объеме 50 мкл 10-кратныйбуфер 100 мМ трис- ( 9, при 5 мкл (1-кратная концентрация) 25 С), 1,0-100, 500 мМ 1,5 мМ 2) Праймер прямой 15 пкМ Праймер обратный 20 пкМ Зонд к дикому типу кодона 10 пкМ Зонд к мутантному типу кодона 10 пкМ Раствор(5 ммоль/мл , , , ) 7,5 мкл 2 (25 мМ) 6 мклполимераза 2,5 ЕД Бетаин (5 М раствор) 5 мкл Свободная от нуклеазы деионизованная вода до 40 мкл Экстрагированная ДНК микобактерий 10 мкл 5 16610 1 2012.12.30 Амплификация. Для осуществления способа молекулярно-генетической диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину с использованием двойных флюоресцирующих зондов реакционные смеси амплифицируют в многоканальном приборе для проведения ПЦР в реальном времени. Режим для проведения амплификации 95 С - 10 мин, 50 циклов (95 С - 35 с, 60 С - 70 с). Детекция флюоресценции проводится на стадии отжига(60 С - 70 с) на каналах ,для кодонов 516, 526, 531. Определение флюоресценции проводят для проб исследуемой ДНК, для положительных контрольных образцов, отрицательных контрольных образцов, фона. Учет и интерпретация результатов. 1. Исключение неспецифической флюоресценции, связанной с денатурацией зонда. Программу учета и оценки результатов, обслуживающую прибор ПЦР в реальном времени, настроить таким образом, чтобы она отражала цикл достижения порогового значения флюоресценции. Флюоресценция должна достигать порогового уровня до 35 цикла. Те результаты флюоресценции, которые достигают порогового уровня на 35 цикле и позже,считать сомнительными. Для таких проб необходимо повторно провести исследование и считать реакцию отрицательной, если пороговый уровень флюоресценции пробы достигают на 35 цикле и позже. 2. Определение порога положительной реакции. Программу учета и оценки результатов, обслуживающую прибор ПЦР в реальном времени, настроить таким образом, чтобы она отражала динамику изменения уровней флюоресценции. Положительными можно считать те пробы, уровень конечной флюоресценции которых удовлетворяет одному из критериев 1) конечный уровень флюоресценции выше порогового, при этом порог равен сумме конечного уровня флюоресценции отрицательного контроля и толерантности. Толерантность равна 25 от максимального уровня флюоресценции, который зарегистрирован в процессе постановки всех проб в одной партии исследований 2) в ходе реакции уровень флюоресценции пробы увеличивается на 25 и более по сравнению с исходным уровнем флюоресценции. 3. Учет и оценка результатов. Принципы учета и оценки результатов приведены в табл. 3. Таблица 3 Интерпретация получаемых результатов определения устойчивости к рифампицину микобактерий туберкулеза с использованием двойных флюоресцирующих зондов Кодоны роВ генаТип кодоКанал Интерпретация п/п на 516 526 531 дикий мутации от- чувствительность 1 дикий дикий дикий сутствуют кмутантныйдикий мутация в устойчивость к 2 мутация дикий дикий 516 мутация в устойчивость к 3 дикий мутация дикий 526 Кодоны роВ генаТип кодоКанал Интерпретация п/п на 516 526 531 дикиймутация мутация мутации в устойчивость к 7 дикий 526, 531 мутантныйв 516 в 526 в 531 516, 526, 531 Мутации есть в 516, 526, 531 кодонах, если в пробирке для 516 кодона зарегистрирована флюоресценция на канале для флюорофора (возбуждение - 520 нм, экстинкция - 548 нм) выше пороговой, при этом на канале для -флюорофора (возбуждение - 492 нм, экстинкция - 517 нм) уровень флюоресценции ниже пороговой в пробирке для 526 кодона зарегистрирована флюоресценция на канале для флюорофора (возбуждение - 520 нм, экстинкция - 548 нм) выше пороговой, при этом на канале для -флюорофора (возбуждение - 492 нм, экстинкция - 517 нм) уровень флюоресценции ниже пороговой в пробирке для 531 кодона зарегистрирована флюоресценция на канале для флюорофора (возбуждение - 520 нм, экстинкция - 548 нм) выше пороговой, при этом на канале для -флюорофора (возбуждение - 492 нм, экстинкция - 517 нм) уровень флюоресценции ниже пороговой. Мутации отсутствуют в 516, 526, 531 кодонах, если в пробирке для 516 кодона зарегистрирована флюоресценция на канале для флюорофора (возбуждение - 492 нм, экстинкция - 517 нм) выше пороговой, при этом на канале для -флюорофора (возбуждение - 520 нм, экстинкция - 548 нм) уровень флюоресценции ниже пороговой в пробирке для 526 кодона зарегистрирована флюоресценция на канале для флюорофора (возбуждение - 492 нм, экстинкция - 517 нм) выше пороговой, при этом на канале для -флюорофора (возбуждение - 520 нм, экстинкция - 548 нм) уровень флюоресценции ниже пороговой в пробирке для 531 кодона зарегистрирована флюоресценция на канале для флюорофора (возбуждение - 492 нм, экстинкция - 517 нм) выше пороговой, при этом на канале для -флюорофора (возбуждение - 520 нм, экстинкция - 548 нм) уровень флюоресценции ниже пороговой. Оценка результатов определения чувствительности. Культуру микобактерий с мутацией хотя бы в одном из кодонов 516, 526, 531 следует считать устойчивой к рифампицину и изониазиду. Примеры полученных результатов и их интерпретация с использованием данного способа приведены в табл. 4 и рисунках. Таблица 4 Результаты, полученные с использованием данного способа, и их интерпретация Уровни флюоресценции Кодон 516 Кодон 526 Кодон 531 п/п мутация мутация нет мутация мутация 16610 1 2012.12.30 Флюоресценция на каналедостигла пороговой величины на 32 цикле, уровень флюоресценции на каналесоставил 3450 единиц, что выше порога (777,69), флюоресценция на каналене превысила пороговую изучаемая культура МБТ не имеет мутаций в 526 кодоне. Фиг. 1. Результаты определения флюоресценции на каналахидля 526 кодона культуры МБТ 765 Флюоресценция на каналене достигла пороговой величины, уровень флюоресценции на каналепревысил порог (250 единиц и 42 соответственно) изучаемая культура МБТ имеет мутации в 531 кодоне. Фиг. 2. Результаты определения флюоресценции на каналахидля 531 кодона 16610 1 2012.12.30 Для данной пробы МБТ отмечается флюоресценция выше пороговой на каналах АМ и , при этом конечный уровень флюоресценции для -канала в 2 раза выше, чем для -канала такие МБТ не содержат мутации. Фиг. 3. Гетерозиготная проба ДНК для 526 кодона Возможные проблемы интерпретации результатов. Флюоресценция выше пороговой может регистрироваться на - и -каналах одновременно. Если на одном из каналов уровень флюоресценции превосходит флюоресценцию на втором канале в 2 раза и более, то положительной считают пробу по доминантному каналу если доминирует , то нет мутаций, если доминирует , то есть мутации. В случае, если для изучаемого кодона уровни флюоресценции идентичны на - и -каналах (такие пробы считаются гетерозиготными) и если в остальных кодонах отсутствуют мутации, то исследования данного образца повторяют. Если мутации присутствуют в других кодонах, то такая МБТ считается устойчивой к рифампицину. Феномен гетерозиготности (наличие положительных результатов на двух каналах) зарегистрирован различными исследователями. Его причины и последствия в настоящий момент уточняются, но, по всей видимости, связаны с одновременным присутствием у пациента как чувствительных, так и резистентных МБТ. В процессе противотуберкулезной терапии происходит селекция резистентных форм, в результате чего развивается приобретенная лекарственная устойчивость МБТ. Результаты лабораторных и клинических испытаний. С использованием предлагаемого способа исследованы 180 проб ДНК МБТ. Интегральная оценка определения чувствительности, специфичности, показателя соответствия, показателя воспроизводимости приведена в табл. 5. 16610 1 2012.12.30 Таблица 5 Интегральная оценка результатов медицинских клинических испытаний тест-системы для молекулярно-генетической диагностики туберкулеза и определения чувствительности к рифампицину (в режиме реального времени),в основу работы которой положен патентуемый метод Клиническая Клиническая Клиническая Показатели база 1 база 2 база 3 Чувствительность определения рези 858689 стентности кСпецифичность определения резистент 97,810096,9 ности кПоказатель соответствия определения 94,9696,992,5 резистентности кПоказатель воспроизводимости опреде 798676 ления резистентности кТаким образом, предлагаемый способ, имеет ряд преимуществ по сравнению с известными, а именно позволяет проводить ускоренное определение чувствительности к рифампицину, прост в исполнении, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Использование метода двойных зондов позволяет проводить более объективную оценку и интерпретацию результатов на основании двух реакций. Источники информации 1. Патент РФ 2297456, 2005. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 10