Биочип для дифференцированной экспресс-диагностики вирусов гриппа А (H1N1), А(H3N2) и В

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БИОЧИП ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ ВИРУСОВ ГРИППА А (11), А(32) И В(71) Заявители Белорусский государственный университет Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Драпеза Александр Иванович Лобан Валерий Александрович Судник Юрий Михайлович Грибкова Наталья Васильевна Лабунов Владимир Архипович(73) Патентообладатели Белорусский государственный университет Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии(57) Биочип для дифференцированной экспресс-диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В, содержащий одноразовый массив биосенсоров на стеклянной подложке с иммобилизованными антителами и информационную систему для работы с данным массивом биосенсоров, отличающийся тем, что информационная система биочипа содержит термостатируемую камеру с отдельными ячейками для массива измерительных и массива 47992008.10.30 референтных сенсоров емкостного типа, первые и вторые входы отдельных ячеек, первые и вторые выходы отдельных ячеек, первый набор силиконовых трубок, перистальтический насос, емкость для дистиллированной воды, воздушный компрессор с фильтром и воздухозаборником, второй набор силиконовых трубок, первый аналоговый мультиплексор, дифференциальный измеритель отношения зарядов с массива измерительных и референтных сенсоров емкостного типа при вынужденной поляризации, дифференциальный измеритель параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики, второй аналоговый мультиплексор, аналого-цифровой преобразователь, узел обработки информации, узел представления информации, узел управления, двунаправленную шину для работы с компьютером через разъем -порта, емкость для отходов, при этом массивы измерительных и референтных сенсоров емкостного типа помещены в соответствующие ячейки термостатируемой камеры, при этом первые входы ячеек термостатируемой камеры соединены с помощью первого набора силиконовых трубок через перистальтический насос с емкостью для дистиллированной воды, а вторые входы ячеек термостатируемой камеры соединены с помощью второго набора силиконовых трубок с выходом воздушного компрессора, содержащего фильтр и воздухозаборник, причем первые выходы ячеек термостатируемой камеры присоединены с помощью первого набора силиконовых трубок к входу емкости для отходов, а вторые выходы ячеек термостатируемой камеры соединены с воздушной средой с помощью второго набора силиконовых трубок, при этом выходы массива измерительных и массива референтных сенсоров емкостного типа присоединены к входам первого аналогового мультиплексора, один выход которого соединен с входом дифференциального измерителя отношения зарядов, а второй выход первого аналогового мультиплексора присоединен к входу дифференциального измерителя параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики, причем выход дифференциального измерителя отношения зарядов присоединен к одному из входов второго аналогового мультиплексора, а выход дифференциального измерителя параметров амплитудночастотной и фазочастотной характеристики соединен с другим входом второго аналогового мультиплексора, выход которого присоединен к входу аналого-цифрового преобразователя, при этом выход аналого-цифрового преобразователя присоединен к входу узла обработки информации, один выход которого для связи с компьютером соединен двунаправленной шиной с разъемом -порта, а другой выход узла обработки информации подсоединен ко входу узла представления информации, содержащего жидкокристаллический дисплей ЖД и светодиодные индикаторы а-для вируса(11), б-для вируса(32), в-для вируса В, при этом выход узла управления присоединен к входам перистальтического насоса, воздушного компрессора, термостатируемой камеры, первого аналогового мультиплексора, дифференциального измерителя отношения зарядов,дифференциального измерителя параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики, второго аналогового мультиплексора, аналого-цифрового преобразователя,узла обработки информации, узла представления информации. Полезная модель биочипа для дифференцированной диагностики вирусов гриппа А(11),(32) и В предназначена для экспресс-диагностики в области эпидемиологии,связанной с ранним обнаружением и надзором за распространением вирусов гриппа среди населения. Известны полезные модели биочипов 1, представленные на рынке высоких технологий различными фирмами (и многими другими) 2,принцип работы которых основан на иммунохимических реакциях вирус-антитело и отличающихся только типом используемых подложек для иммобилизации антител, технологиями иммобилизации антител на подложках и технологиями детекции информационного сигнала. При этом типы подложек и технологии иммобилизации, предложенные известными производителями систем типа биочип, достаточно разнообразны и определены специфическими особенностями как используемых антител, так и определяемых с помощью их вирусов. В основе технологий выделения информационного сигнала в коммерческих системах типа биочип 1, 2 лежат в основном оптические методы детекции (флуоресценции, поверхностно-плазмонного резонанса или массоспектрометрии). Однако информационные технологии, реализованные в указанных выше устройствах,достаточно дороги и хорошо защищены от несанкционированного воспроизведения. Это приводит пользователя к полной зависимости от зарубежного рынка расходных материалов и услуг, расходы на которые при эффективном использовании данных устройств значительно превышают стоимость самих устройств. В данных устройствах наиболее действенной формой защиты информации выступает наукоемкость самой информационной технологии, связанная с особенностями методов и режимов измерения, методов обработки получаемой информации, учитывающих специфические свойства антител и вирусов, а также физико-химические свойства используемых реагентов. Все это в совокупности определяет невозможность изменения типа или структуры используемых в этих устройствах расходных материалов. Кроме того, такого рода системы ограничено применимы, включая и случаи биотерроризма, в силу их высокой стоимости и сложности, обуславливающей их громоздкость. Например, стоимость одноразовых массивов биосенсоров 1,2, принцип преобразования информации в которых основан на методе поверхностно-плазмонного резонанса, составляет 150-250 , а стоимость технических средств для работы с этими массивами лежит в пределах 265000-365000 . Стоимость одноразового массива биосенсоров, работа которого основана на флуоресцентном методе детекции, составляет около 15 . При этом стоимость технических средств для работы с данным массивом лежит в пределах 70000220000 . Для массоспектрометрических технологий детекции информационного сигнала аналогичные параметры имеют соответственно следующие стоимостные показатели 40-60 и 160000 . Известны полезные модели биочипов, основанные на различных методах измерения(кондуктометрии, вольтамперометрии, потециометрии) электрических параметров раствора, в котором происходит иммунохимическая реакция вирус-антитело 3-8, с помощью которых также можно определять наличие различных типов вируса гриппа. 3 47992008.10.30 Однако во всех этих известных типах полезных моделей предполагается, что взаимодействие вирус-антитело является абсолютно специфическим. В то же время - это не всегда так. Не все иммобилизованные на подложку антитела, в силу разных причин, могут проявлять абсолютную специфичность. Существует вероятность того, что часть моноклональных антител, обладающих аффинным сродством к эпитопу одного типа вируса, в процессе привязки может частично видоизменить свои конформационные свойства и давать ложноположительную реакцию при неспецифических взаимодействиях антителовирус. Кроме того, существует и вероятность того, что тот или иной природный белок вируса (антиген), ответственный за связь с иммобилизованным к подложке антителом, может видоизменить строение своего эпитопа в результате различных мутаций, что будет приводить к ложноотрицательным результатам измерения. Таким образом, для идентификации возбудителей недостаточно обнаружения только самого факта связывания вируса гриппа с иммобилизованным антителом. Для более надежной дифференцированной диагностики требуется набор идентифицирующих признаков самой реакции вирус-антитело,позволяющий создать специфический фазовый портрет данной реакции. Наиболее близким техническим решением к заявляемому устройству является устройство 9, в котором используется одноразовый массив биосенсоров на стеклянной подложке с иммобилизованными антителами и информационная система для работы с данным массивом, позволяющая пользователю получить информацию о наличии различных типов вирусных частиц в исследуемых образцах в виде объемного представления гистограмм. Две координаты гистограммы характеризуют площадь привязки определенного типа антител, а третья координата показывает суммарную интенсивность свечения флуоресцентных меток с данной площади. Однако данный прототип системы типа биочип имеет практически те же, отмеченные выше, недостатки при идентификации вирусов гриппа. При детекции информационных сигналов с использованием такого типа полезной модели также предполагается, что взаимодействие вирус-антитело является абсолютно специфическим, поскольку используется принцип наличия или отсутствия только одного типа информационного признака, характеризующего иммунохимическое взаимодействие вирус-антитело, который обусловлен свечением метки. Кроме того, высокая технологичность, присущая для такого рода полезных моделей,которая обусловлена автоматизацией подготовки образцов, высокоточным сканированием площади детекции, обеспечением однотипности условий измерения, реализацией принципа многоканальных оптических измерений, обработки информации для представления ее пользователю в наиболее удобной форме, приводит, как правило, к их высокой стоимости,что резко ограничивает возможности организации высокоэффективных систем раннего обнаружения и надзора за распространением различных вирусных инфекций среди населения. В этом отношении более широкими функциональными возможностями обладают идентифицирующие признаки реакции вирус-антитело, полученные на пространстве измеренных электрических параметров этой реакции. К тому же техническая реализация полезной модели устройства для измерения информационных электрических параметров обходится значительно дешевле полезной модели устройства на основе оптических методов флуоресцении, поверхностно-плазмонного резонанса или массоспектрометрии. Задачей создания полезной модели биочипа для дифференцированной диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В является снижение стоимости и повышение точности дифференцированной диагностики вирусов гриппа на основе использования иммунохимических взаимодействий вирус-антитело и электрических методов детекции информационных сигналов. Поставленная задача реализуется тем, что в биочипе для дифференцированной экспресс-диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В, содержащем одноразовый 4 47992008.10.30 массив биосенсоров на стеклянной подложке с иммобилизованными антителами и информационную систему для работы с данным массивом биосенсоров, информационная система биочипа содержит термостатируемую камеру с отдельными ячейками для массива измерительных и массива референтных сенсоров емкостного типа, первые и вторые входы отдельных ячеек, первые и вторые выходы отдельных ячеек, первый набор силиконовых трубок, перистальтический насос, емкость для дистиллированной воды, воздушный компрессор с фильтром и воздухозаборником, второй набор силиконовых трубок, первый аналоговый мультиплексор, дифференциальный измеритель отношения зарядов с массива измерительных и референтных сенсоров емкостного типа при вынужденной поляризации,дифференциальный измеритель параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики, второй аналоговый мультиплексор, аналого-цифровой преобразователь,узел обработки информации, узел представления информации, узел управления, двунаправленную шину для работы с компьютером через разъем -порта, емкость для отходов, при этом массивы измерительных и референтных сенсоров емкостного типа помещены в соответствующие ячейки термостатируемой камеры, при этом первые входы ячеек термостатируемой камеры соединены с помощью первого набора силиконовых трубок через перистальтический насос с емкостью для дистиллированной воды, а вторые входы ячеек термостатируемой камеры соединены с помощью второго набора силиконовых трубок с выходом воздушного компрессора, содержащего фильтр и воздухозаборник,причем первые выходы ячеек термостатируемой камеры присоединены с помощью первого набора силиконовых трубок к входу емкости для отходов, а вторые выходы ячеек термостатируемой камеры соединены с воздушной средой с помощью второго набора силиконовых трубок, при этом выходы массива измерительных и массива референтных сенсоров емкостного типа присоединены к входам первого аналогового мультиплексора,один выход которого соединен с входом дифференциального измерителя отношения зарядов, а второй выход первого аналогового мультиплексора присоединен к входу дифференциального измерителя параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики, причем выход дифференциального измерителя отношения зарядов присоединен к одному из входов второго аналогового мультиплексора, а выход дифференциального измерителя параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики соединен с другим входом второго аналогового мультиплексора, выход которого присоединен к входу аналого-цифрового преобразователя, при этом выход аналого-цифрового преобразователя присоединен к входу узла обработки информации, один выход которого для связи с компьютером соединен двунаправленной шиной с разъемом -порта, а другой выход узла обработки информации подсоединен ко входу узла представления информации, содержащего жидкокристаллический дисплей ЖД и светодиодные индикаторы а для вируса(11), б - для вируса(32), в - для вируса В, при этом выход узла управления присоединен к входам перистальтического насоса, воздушного компрессора,термостатируемой камеры, первого аналогового мультиплексора, дифференциального измерителя отношения зарядов, дифференциального измерителя параметров амплитудночастотной и фазочастотной характеристики, второго аналогового мультиплексора, аналого-цифрового преобразователя, узла обработки информации, узла представления информации. Сущность полезной модели поясняется фиг. 1-2. На фиг. 1 приведена функциональная схема заявляемой полезной модели биочипа для дифференцированной диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В. На фиг. 2 приведена временная диаграмма работы заявляемой полезной модели биочипа для дифференцированной диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В. В таблице приведены информационные параметры вирусов гриппа для различных типов иммунохимических реакций, полученные в процессе калибровки для надежности 95 и количестве измерений 6 для каждого из представленных типов вируса гриппа. 5 47992008.10.30 Заявляемая полезная модель устройства типа биочип содержит термостатируемую камеру 1 с отдельными ячейками для массива измерительных 1 а и массива референтных сенсоров 1 б емкостного типа, первые 1 с и вторые 1 г входы отдельных ячеек, первые 1 е и вторые 1 и выходы отдельных ячеек, первый набор силиконовых трубок 1 в, перистальтический насос 2, емкость для дистиллированной воды 3, воздушный компрессор 4 с фильтром 5 и воздухозаборником 6, второй набор силиконовых трубок 1 д, первый аналоговый мультиплексор 7, дифференциальный измеритель отношения зарядов с массива измерительных и референтных сенсоров емкостного типа при вынужденной поляризации 8,дифференциальный измеритель параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики 9, второй аналоговый мультиплексор 10, аналого-цифровой преобразователь 11, узел обработки информации 12, узел представления информации 13, узел управления 14, двунаправленную шину для работы с компьютером 17 через разъем -порта 15, емкость для отходов 16. Работу заявляемой полезной модели устройства типа биочип для дифференцированной диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В рассмотрим на примере используемого для этих целей массива емкостных сенсоров интегрального типа, электроды которых были изготовлены методами микроэлектроники по индий-олово-оксидной технологии на стеклянных подложках. Исходно изготовленные стеклянные подложки отбираются таким образом, чтобы все измерительные 1 а и референтные 1 б емкостные сенсоры имели идентичные номинальные значения емкости и проводимости. Для этих целей их отбирают, например, с помощью прибора Е 7-12 А. К чувствительным областям каждого отдельного емкостного сенсора, находящимся на одной стеклянной подложке, иммобилизуют соответствующее антитело против одного из группы вирусов гриппа(11),(32) и В, используя для этого известные методы ковалентной пришивки антител к подложкам на основе силанов и методы нейтрализации непрореагировавших с антителами альдегидных групп с помощью этаноламина 10. Аналогичную иммобилизацию проводят для всех остальных емкостных сенсоров на других стеклянных подложках. После чего,используя суспензии вирусов(11), А (32) и В, проводят калибровку заявляемой полезной модели следующим образом. Две стеклянные подложки с тремя измерительными 1 а и тремя референтными 1 б емкостными сенсорами помещаются в соответствующие ячейки термостатируемой камеры 1, которая предварительно была прогрета до заданной температуры в пределах 25,037,0 С. После этого в ячейку термостатируемой камеры 1,где находится стеклянная подложка с измерительными 1 а емкостными сенсорами, добавляют суспензию вируса гриппа (11) определенной концентрации в определенном растворителе. В ячейку термостатируемой камеры 1, содержащую стеклянную подложку с референтными 1 б емкостными сенсорами, добавляют только соответствующий растворитель. В термостатируемой камере 1 суспензию вируса гриппа(11) определенной концентрации оставляют на время инкубации инк. (фиг. 2). После истечения времени инк. включается перистальтический насос 2, который с помощью первого набора силиконовых шлангов 1 в через первые 1 с и вторые 1 г входы, а также первые 1 е и вторые 1 и выходы производит промывку дистиллированной водой ячеек термостатируемой камеры 1 с измерительными 1 а и референтными 1 б емкостными сенсорами из емкости для дистиллированной воды 3 в течение времени пром. При этом отходы промывки удаляют в емкость для отходов 16. Затем в течение времени сушк. с помощью второго набора силиконовых шлангов 1 д, подключенных к воздушному компрессору 4, содержащему фильтр 5 и воздухозаборник 6, производится сушка объемов ячеек термостатируемой камеры 1 с измерительными 1 а и референтными 1 б емкостными сенсорами. По истечении интервала времени сушк. производится измерение идентифицирующих параметров реакции вирусантитело для вируса(11) (фиг. 2). Для этого аналоговый мультиплексор 7 по одному из своих выходов подключает в течение времени изм.1 попарно измерительные и референтные емкостные сенсоры к дифференциальному измерителю отношения зарядов 8. 6 47992008.10.30 Информационный параметр, регистрируемый дифференциальным измерителем отношения зарядов 8, получают путем измерения дифференциальных кинетик изменения тока в условиях попарного сравнения вынужденной поляризации поверхности емкостных сенсоров в диапазонах напряжений 0300 мВ и 0-300 мВ и последующего расчета отношения зарядов -/в узле обработки информации 12 по площадям, ограниченным кривыми, полученными при измерении кинетических зависимостей. Фактически данный информационный параметр характеризует отличие в степени электрической поляризуемости поверхностей емкостных сенсоров, содержащих различные типы иммобилизованных антител после взаимодействия их с вирусом гриппа(11). Для получения данного информационного параметра все емкостные сенсоры в течение времени пол. попарно вынужденно поляризуются подачей на них линейно нарастающего напряжения сначала в диапазоне от 0 мВ до 300 мВ, а затем в диапазоне от 0 мВ до -300 мВ. После каждого типа вынужденной поляризации на электроды емкостных сенсоров подают нулевой потенциал и в течение последующего интервала времени кин., равного по длительности времени пол.,проводится измерение дифференциальных кинетик изменения токови -, протекающих по поверхности различных пар, состоящих из измерительных и референтных емкостных сенсоров. Одновременно с этим цифровой эквивалент информации о данных кинетиках через один из входов аналогового мультиплексора 10 и с помощью аналого-цифрового преобразователя 11 заносится в соответствующие ячейки памяти узла обработки информации 12 для накопления и последующей статистической и информационной обработки. Через другой выход аналогового мультиплексора 7 по истечении времени изм.1 подключают попарно измерительные 1 а и референтные 1 б емкостные сенсоры к дифференциальному измерителю параметров амплитудно-частотной и фазочастотной характеристики 9 в диапазоне частот 1400 кГц. Измерение дифференциальных параметров амплитудночастотной и фазочастотной характеристики проводят в течение времени изм.2 (фиг. 2). Цифровой эквивалент дифференциальных изменений действительнойи мнимойчасти импеданса поверхности емкостных сенсоров от частоты, которые обусловлены взаимодействием различных типов иммобилизованных антител с вирусом гриппа(11), через другой вход аналогового мультиплексора 10 и с помощью аналогоцифрового преобразователя 11 также заносится в соответствующие ячейки памяти устройства обработки информации 12 для накопления и последующей статистической и информационной обработки. Вышеописанную калибровку заявляемого устройства типа биочип проводят аналогичным образом и для вирусов гриппа(32) и В. Для повышения степени надежности до уровня 95 при дифференцированной диагностике вирусов гриппа А (11),(32) и В калибровку проводят для количества измерений не менее шести для каждого типа вирусов гриппа. Цикл калибровки завершается (фиг. 2) получением в пространстве выбранных информационных параметров с помощью узла обработки информации 12 за время обр.калибр. их среднеарифметических значений и доверительных интервалов с 95 степенью надежности для всех типов иммунохимических реакций, как показано в таблице. Цикл калибровки системы типа биочип проводится только один раз и используется в дальнейшем для сравнения с результатами, получаемыми в циклах измерений на исследуемых клинических образцах. Информационные параметры АЧХ и ФЧХ, приведенные в таблице, являются соответственно составляющими реальнойи мнимойчастей импеданса модифицированных поверхностей. В статистических расчетах узлом обработки информации 12 данные информационные параметры берутся только для одной специфической частоты,при которой наблюдаются наибольшие изменения в значениях этих параметров для различных типов иммунохимических реакций. Полученные значения хранятся в соответствующих ячейках памяти узла обработки информации 12. 47992008.10.30 При дифференцированной диагностике вирусов гриппа(11),(32) и В в исследуемых клинических образцах проводят цикл измерений, аналогичный циклу калибровки (фиг. 2). При цикле измерений также получают таблицу среднеарифметических значений рассмотренных выше информационных параметров и их доверительных интервалов с 95 степенью надежности для всех типов иммунохимических реакций, состоявшихся при взаимодействии всех типов вируса гриппа, находящихся в клинических образцах, с антителами, иммобилизованными на измерительных 1 а емкостных сенсорах. Цикл измерений проводится с использованием не менее трех измерительных и трех референтных стеклянных подложек, аналогичных тем, которые используются в цикле калибровки. После этого узел обработки информации 12 за время обр.изм. и инд. производит сравнение в пространстве координат АЧХ-ФЧХ, АЧХ - -/, ФЧХ - -/ результатов двух таблиц по всему набору информационных признаков, характеризующих специфические и неспецифические иммунохимические реакции вирус-антитело, обеспечивая идентификацию вируса(ов) гриппа(11), А (32) и В в исследуемых клинических образцах. Результаты обнаружения и идентификации вируса(ов) гриппа(11),(32) и В высвечиваются либо с помощью светодиодов, либо в виде определенных зон,характерных для исследуемых типов вирусов, на экране жидкокристаллического дисплея ЖД при подаче импульса инд. на узел представления информации 13. Для расширения функциональных возможностей заявляемой полезной модели биочипа при представлении информации пользователю или, например, при дифференцированной диагностике других типов вирусных инфекций в заявляемой полезной модели биочипа предусмотрена двунаправленная шина 17 для работы с компьютером через разъем -порта 15. Таким образом, решена задача создания устройства для дифференцированной диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В, имеющего более низкую стоимость и повышенную точность дифференцированной диагностики по отношению к прототипу,поскольку в заявляемом устройстве используются более дешевые электрические методы детекции информационных параметров и набор информационных признаков для идентификации вирусов на основе как специфических, так и неспецифических иммунохимических взаимодействий вирус-антитело. Биочип для дифференцированной экспресс-диагностики вирусов гриппа(11),(32) и В Информационные параметры Тип иммунохимической реакции АЧХ, мВ ФЧХ, мВ Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9