Лупановые тритерпеноиды, ингибирующие размножение вируса гриппа

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ЛУПАНОВЫЕ ТРИТЕРПЕНОИДЫ, ИНГИБИРУЮЩИЕ РАЗМНОЖЕНИЕ ВИРУСА ГРИППА(71) Заявители Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики БеларусьИнститут органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук(72) Авторы Бореко Евгений Иванович Флехтер Оксана БорисовнаНигматуллина Лена РамилевнаБалтина Лидия АшрафовнаГалин Фанур ЗуфаровичТолстиков Генрих Александрович(73) Патентообладатели Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения Республики БеларусьИнститут органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук 2 28 ,7811 1 2006.02.28 Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть использовано для подавления размножения вирусов гриппа. Известны противовирусные свойства тритерпеноида лупанового ряда, бетулиновой кислоты, в отношении вируса герпеса простого 1. Более высокими противовирусными свойствами в отношении вируса герпеса простого обладают другие тритерпеноиды лупанового ряда, бетулоновая кислота и бетулин 2, 3. Бетулин не обладает противовирусными свойствами в отношении вирусов гриппа 4. В патентной и научно-технической литературе информация о противовирусных свойствах лупановых тритерпеноидов в отношении вирусов гриппа отсутствует. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противовирусным действием. Поставленная задача достигается применением ряда новых лупановых тритерпеноидов 3-оксим-бетулоновой кислоты , 3,28-диоксим-бетулина . 3-гидрокси-28-оксимбетулинаи 3-О-ацетил-28-фталата бетулинаследующего строения 3 1( ) 2- ,1( ) -,2 1- 2-,1-3 2-264 3 1 3 3 Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить новые тритерпеноиды ряда лупана 3-оксим-бетулоновую кислоту, 3,28-диоксим-бетулина, 3-гидрокси 28-оксим-бетулина и 3-О-ацетил-28-фталат бетулина в качестве ингибиторов размножения вируса гриппа. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Получение 3-оксим-бетулоновой кислоты (соединение 5). К 0,98 г (2 ммоль) бетулоновой кислоты в 30 мл сухого пиридина добавляют 1,0 г гидрохлорида гидроксиламина и кипятят 2 ч. Реакционную массу выливают в 5 водный раствор соляной кислоты, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Остаток перекристаллизовывают из этанола. Выход 0,89 г (89 ). Тпл.223-225 С. Найдено,С-76,55 Н-10,28 -2,97. С 30 Н 48 О 3. Вычислено,С-76,15 Н-9,18 -2,87. Спектр 1 Н ЯМР (, м.д., 3) 0,96 0,99 1,01 1,07 1,12 (5 с, 15 Н, 5 СН 3) 1,00-2,00 (м, СН, СН 2) 1,67 (с, 3 Н, Н-30) 2,22-2,32 (м, 1 Н, Н-19) 4,60 и 4,75 (оба уш.с, 2 Н, Н-29) 8,20 (уш.с, 1 Н,-3). Спектр 13 С ЯМР (, м.д., 3) 14,6 15,8 15,9 16,1 17,1 19,0 19,3 21,1 22,8 25,2 27,2 29,6 30,6 32,1 33,9 36,9 37,2 38,3 38,7 40,3 40,7 42,4 46,9 49,4 50,1 51,2 55,6 110,1 (С-29) 149,8 (-20) 167,3 (-3) 181,3 (С-28). Пример 2. Получение 3,28-диоксим-бетулина (соединение 6). Смесь 0,44 г (1 ммоль) 3-кето-бетулинового альдегида и 1,0 г гидрохлорида гидроксиламина в 10 мл пиридина кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную массу выливают в 5 водный раствор соляной кислоты, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Остаток перекристаллизовывают из СНС 3-МеОН, выход 0,38 г (85 ). Тпл.244-246 С. Найдено,С-76,68 Н-10,60 -5,74. 304822. Вычислено,С-76,92 Н-10,26 -5,98. ИК-спектр (, см-1, вазелиновое масло) 3240, 1905, 1645, 2 7811 1 2006.02.28 1616, 1430, 1380, 1120, 1020, 940, 890, 750, 735, 710. Спектр 1 Н ЯМР (, м.д., 3) 0,95 0,98 1,02 1,05 1,12 (5 с, 15 Н, 5 СН 3 ) 1,00-2,00 (м, СН, СН 2 ) 1,76 (с, 3 Н, Н-30) 2,222,32 (м, 1 Н, Н-194,62 и 4,76 (оба уш.с, 2 Н, Н-29) 7,24 (с, 1 Н, Н-28) 7,58 (уш.с, 1 Н, -28) 8,21 (уш.с, 1 Н, -3). Спектр 13 С ЯМР (, м.д., 3) 14,6 15,8 16,0 17,2 19,0 19,2 21,1 22,9 25,2 27,3 27,8 27,9 29,7 32,4 33,9 36,9 37,2 38,6 38,7 40,3 42,2 45,6 49,3 49,8 49,9 54,4 110,1 (С-29) 149,8 (С-20) 155,5 (С-28) 167,3 (С-3). Пример 3. Получение 3-гидрокси-28-оксим-бетулина (соединение 7). Смесь 0,48 г (1 ммоль) 3-О-ацетил-бетулинового альдегида и 0,5 г гидрохлорида гидроксиламина в 10 мл пиридина кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную массу выливают в 5 водный раствор соляной кислоты, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Остаток растворяют в 25 мл 5 раствора КОН в метаноле и кипятят с обратным холодильником 3 ч. Выливают смесь в холодную воду, осадок отфильтровывают , промывают водой до нейтральной реакции . Остаток хроматографируют на окиси алюминия , элюируя хлороформом, выход 0,32 г (70 ). Тпл.223-225 С. Найдено,С-78,99 Н-10,88 -3,24, 30492. Вычислено,С 78,69 Н-10,75 -3,07. ИК-спектр (, см-1, вазелиновое масло) 3480 2210 1655 1640 1568 1385 1136 930 888 795 730. Спектр 1 Н ЯМР (. м.д., 3) 0,78 0,84 0,99 1,06 1,12 (5 с, 15 Н, 5 СН 3) 1,05-2,00 (м, СН, СН 2) 1,68 (с, 3 Н, Н-30) 2,44-2,58 (м, 1 Н, -19) 4,42-4,47 (м, 1 Н, Н-3) 4,60 и 4,72 (оба уш.с, 2 Н, Н-29) 7,38 (с, 1 Н, Н-28) 7,67 (уш.с, 1 Н,-28) 8,84 (с, 1 Н, ОН-3). Спектр 13 С ЯМР (, м.д., 3)14,7 15,3 15,9 16,0 18,2 19,1 20,7 25,0 25,1 27,2 27,7 27,9 29,6 32,2 34,2 37,1 38,5 38,6 38,8 40,8 42,7 47,8 49,3 49,7 50,3 55,2 78,9 (С-3) 110,0 (С-29) 149,7 (С-20) 155,2 (С 28). Пример 4. Получение 3-О-ацетил-28-фталата бетулина (соединение 8). Смесь 0,48 г (1 ммоль) 3-О-ацетил-бетулина и 0,3 г (2 ммоль) фталевого ангидрида кипятят в 10-15 мл безводного пиридина 15 ч. Реакционную массу разбавляют 200 мл холодной воды, подкисляют 10 раствором соляной кислоты и экстрагируют бензолом. Экстракт промывают водой, 5 раствором соляной кислоты, снова водой, сушат над 4 и упаривают в вакууме. Выход 0,59 г (93 ). Тпл.174-176 С. Найдено,С - 75,64 Н-8,58. С 40 Н 56 О 6 Вычислено,С-75,89 Н-8,94. Спектр 1 ЯМР (, м.д., 13) 0,75 0,81 0,96 0,97 1,03 (5 с, 15 Н, 5 СН 3) 1,05-2,00 (м, С 2, СН) 1,68 (с, 3 Н, 3) 2,00 (с, 3 Н, ОАс) 2,45-2,50 (м, 1 Н, Н 19), 4,38-4,43 (м, 1 Н, Н 3), 3,98 и 4,41 (оба д, по 1 Н, Н 28, 11 Гц), 4,60 и 4,71 (оба уш. сигнала, по 1, Н 29) 7,35-7,40 (м, 2 Н, Н 2, Н 3) 7,45-7,55 (м, 1 Н, Н 1) 7,657,75 (м, 1, Н 4). Спектр 13 С ЯМР (. м.д., 3) 14,7 16,0 16,1 16,5 18,1 19,1 20,8 21,2 23,6 25,1 27,0 27,9 29,5 29,7 34,0 37,0 37,6 37,7 38,3 40,8 42,7 46,4 47,7 48,9 50,2 55,3 64,4 (С -28) 81,0 (С-3) 109,9 (С -29) 128,7 129,8 130,1 130,6 132,0 133,7(С аромат.) 150,0 (С-20) 168,5 171,2 (-О-СО) 172,4 (СООН). Пример 5. При проведении испытаний с вирусом гриппа //34 (71) используют культуру клеток первичных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Испытания проводят методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса в пределах 0,01-0,00001 БОЕ/клетка путем нанесения на клетки вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37 С. Затем жидкость удаляют и клетки покрывают расплавом питательного покрытия на основе концентрата среды 199 с добавлением 1 бактагара и 0,005 нейтрального красного(все реактивы ) и различных концентраций исследуемых соединений. Соединения -, 3 7811 1 2006.02.28 а также бетулин предварительно растворяют в 10 этаноле. После застывания покрытия флаконы помещают в термостат на 36 ч и затем подсчитывают количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя. На основе количества бляшек вычисляют титр вируса. Критерием противовирусного действия считают наличие различий в сравнении с контролем вируса. Вычисляют также концентрацию 50 подавления размножения вируса (среднеэффективная концентрация. 50) и отношение максимальной переносимой концентрации (МПК) к ЕС 50. МПК соединений для неинфицированных культур клеток определяют после 72 ч инкубации. Полученные результаты приведены в таблице. Противовирусные свойства 3-оксим-бетулоновой кислоты ,3,28-диоксим-бетулина , 3-гидрокси-28-оксим-бетулинаи 3-О-ацетил-28 фталата бетулинав отношении вируса гриппа Соедине- Концентрание ция, мкг/мл Как видно из данных таблицы, все исследованные соединения подавляют размножение вируса гриппа в культуре клеток. Наиболее выраженными противовирусными свойствами обладает 3-оксим-бетулоновая кислота . В то же время у препарата сравнения,бетулина, противовирусные свойства отсутствуют. Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При использовании 3-оксим-бетулоновой кислоты, 3,28-диоксим-бетулина, 3-гидрокси-28 оксим-бетулина и 3-О-ацетил-28-фталата бетулина удается получить подавление размножения вируса гриппа в культуре клеток. Заявляемое химическое соединение может быть использовано в исследовательской лабораторной практике непосредственно в настоящий момент для подавления размножения вирусов гриппа и редукции вызываемого ими заболевания. В связи с установленными свойствами данные вещества имеют большое практическое значение. На их основе могут быть разработаны лекарственные формы препаратов для лечения и профилактики гриппа. Ожидается, что такие препараты будут эффективны также и при инфекции, вызванной вариантом вируса гриппа, устойчивым к действию известного лекарственного средства ремантадина, а также при развитии лекарственной устойчивости в ходе лечения. Следовательно, в таких случаях может быть оправдано применение средств на основе 3-оксим-бетулоновой кислоты, 3,28-диоксим-бетулина, 3-гидрокси-28 оксим-бетулина и 3-О-ацетил-28-фталата бетулина в качестве препаратов для самостоятельной или комбинированной терапии. Препараты на основе 3-оксим-бетулоновой кислоты, 3,28-диоксим-бетулина, 3-гидрокси-28-оксим-бетулина и 3-О-ацетил-28-фталата бетулина могут иметь применение и при профилактике гриппа, особенно в коллективах полузакрытого типа, в частности семейных очагах. При появлении заболевших в таких коллективах для лечения, как правило, используют ремантадин как наиболее эффективный этиотропный препарат. Однако после нескольких дней приема ремантадина больной становится распространителем ремантадинустойчивого вируса гриппа, который может вызвать заболевание у остальных членов коллектива 9. При этом применение ремантадина лицами окружения с профилактической или лечебной целью может быть уже не столь эффективным. В данном случае целесообразно профилактическое применение препаратов на основе 3-оксим-бетулоновой кислоты, 3,28-диоксим-бетулина, 3-гидрокси-28 оксим-бетулина и 3-О-ацетил-28-фталата бетулина самостоятельно или в комбинации с ремантадином. Для выработки окончательных рекомендаций но применению 3-оксим-бетулоновой кислоты, 3,28-диоксим-бетулина, 3-гидрокси-28-оксим-бетулина и 3-О-ацетил-28-фталата бетулина с целью лечения и профилактики вирусных инфекций, в том числе тех из них,которые вызываются вариантами возбудителей, устойчивыми к известным и применяющимся препаратам, необходимы изучение безвредности, разработка лекарственной формы, клинические испытания и отработка оптимальных схем применения. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.