Синергичные иммуномодулирующие композиции на основе L-аргинина

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СИНЕРГИЧНЫЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ -АРГИНИНА(71) Заявитель Учреждение образования 6506736 1, 2003. Белорусский государственный ме 46241 , 2009. дицинский университет 2005/102319 2.(72) Авторы Бизунок Наталья Анатольев- . //. на Дубовик Борис Валентинович. - 1996. - . 56. - . 1. - . 341(73) Патентообладатель Учреждение об 357. разования Белорусский государст .. //венный медицинский университет. - 2008. - . 52.(57) Синергичная иммуномодулирующая композиция, содержащая -аргинин и в качестве синергиста мелатонин при молярном соотношении -аргининмелатонин (101)-(11), или ресвератрол и мелатонин при молярном соотношении -аргининресвератролмелатонин(10001100)-(1000110), или ацетилсалициловую кислоту при молярном соотношении-аргининацетилсалициловая кислота 101, или аденозинтрифосфорную кислоту и ацетилсалициловую кислоту при молярном соотношении -аргининаденозинтрифосфорная кислотаацетилсалициловая кислота (111)-(100110), или инозин и салициловую кислоту при молярном соотношении -аргинининозинсалициловая кислота (10101)-(1011). Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, гематологии, фармакологии, фармации, терапии, и может быть использовано для разработки новых лекарственных средств иммуномодулирующего типа действия и алгоритмов комбинированной фармакотерапии. Способность фагоцитов продуцировать и выделять в окружающую среду активные формы кислорода (АФК) называется оксидантным (окислительным) взрывом. Это явление имеет важное биологическое значение для нормального функционирования иммунитета,поскольку обеспечивает разрушение фагоцитированных чужеродных объектов. Недостаточность ферментного комплекса (-оксидазы), ответственного за реализацию оксидантного взрыва, приводит к тяжелому заболеванию - хронической гранулематозной болезни. В то же время, избыточная продукция АФК фагоцитами является одной из при 17812 1 2013.12.30 чин многих патологических состояний, включая ишемическо-реперфузионные повреждения миокарда, атеросклероз, гепатиты и циррозы печени, хронические артриты (в том числе подагрический), хронические воспалительные заболевания легких и реакцию отторжения трансплантата. В связи с этим поиск веществ, способных подавлять оксидантный взрыв фагоцитов и посредством этого оказывать лечебный эффект, является актуальным направлением работ в области иммунофармакологии. Иммуномодуляция (иммунокоррекция) - исправление дефектного функционирования иммунной системы, проявляющееся в усилении ослабленного или торможении стимулированного звена иммунитета. Известны иммуномодуляторы, подавляющие оксидантные функции фагоцитов -аргинин 1, аскорбиновая кислота 2, 3, альфа-токоферол 4, 5, колхицин 6, мелатонин 7, ресвератрол 8, препараты эхинацеи, циклоспорин, микофеноловая кислота, цитостатики, глюкокортикостероиды и др. 9. Наиболее близким по технической сущности является применение -аргинина в качества иммуномодулятора, подавляющего оксидантные функции фагоцитов. Он подавляет оксидантный взрыв фагоцитов при изолированном применении 1, обладая при этом умеренной эффективностью. Кроме того, -аргинин обладает рядом других иммуномодулирующих эффектов. Известны композиции -аргинина, модифицирующие функции лимфоцитов 10 и эффекты лимфокинов 11. Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, - усиления эффективности иммуномодулирующих лекарственных средств. Поставленная задача решается применением следующих предлагаемых синергичных композиций в качестве иммуномодулирующих средств на основе -аргинина и дополнительно содержат усилитель биологической активности, выбранный из группы антиоксидант, витаминный препарат, иммуномодулятор или их сочетание при следующих молярных соотношениях компонентов Синергизм в фармакологии - это явление взаимного усиления эффективности лекарственных средств при их совместном применении по сравнению с применением изолированным. Создание синергичных комбинаций являются важнейшим направлением разработки новых лекарственных средств и фармакотерапевтических тактик. Фармакодинамический синергизм лекарственных средств не только оправдывает их совместное назначение, но и позволяет уменьшить дозы каждого из компонентов комбинации, что минимизирует побочные эффекты и токсические риски. Заявляемые композиции -аргинина в литературе не описаны. Заявляемые композиции проявляют неочевидные свойства, состоящие в усилении иммуномодулирующего потенциала входящих в их состав компонентов, что позволяет применять эти комбинации в качестве средств, подавляющих функцию фагоцитарных клеток,связанную с оксидантным взрывом и массивной продукцией активных форм кислорода 3(АФК), повреждающих окружающие ткани при воспалении, ишемии-реперфузии, эндотелиальной дисфункции и др. патологических состояниях. Заявляемые свойства комбинаций подтверждаются примером. Пример. Действие фармакологически активных веществ и их комбинаций на окислительный взрыв фагоцитов исследовали на перитонеальных макрофагах крыс. Вещества, использованные в работе, были получены от , Германия (мелатонин, ацетилсалициловая кислота, салициловая кислота) и -, Германия (ресвератрол, аденозинтрифосфорная кислота, инозин, таурин, -аргинин) Каждую комбинацию тестировали в 3-5 комбинаторных сочетаниях в широком интервале концентраций. Количество повторных тестов для индивидуальных соединений и комбинацийсоставляло от 3 до 6. Изученные синергичные комбинации -аргинина, комбинаторные сочетания компонентов и интервалы их концентраций представлены в табл. 1. Таблица 1 Изученные синергичные комбинации -аргинина, комбинаторные сочетания и концентрации компонентов КОК 1 Интервал С, моль/л 1 2 3-Аргинин 10 10 10-2-10-7 К 6 Инозин 10 1 10-3-10-6 СК 1 1 10-2-10-6 1 Комбинаторное отношение компонентов (молярное) АСК - ацетилсалициловая кислота СК - салициловая кислота. Состав комбинации Генерируемые макрофагами при окислительном взрыве АФК регистрировали методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре 1251 (Финляндия). Исследование начинали через 10 мин после внесения отдельных компонентов или их комбинаций в кювету люминометра, содержащую 10 жизнеспособных макрофагов в растворе Хенкса, люминол (710-5 моль/л), индуктор окислительного взрыва фагоцитов опсонизированный зимозан 12 - в количестве 5107 частиц. Объем пробы составлял 1 мл,средой являлся раствор Хенкса без индикатора. Влияние соединений на жизнеспособность макрофагов изучали в тесте с трипановым синим (0,1 ) 13. Регистрацию ЛХЛ проводили при 37 С на протяжении 40 мин. Количественную оценку образования АФК осуществляли по площади под кривой ЛХЛ, исключая фоновое свечение клеток ( ХЛ, мВ). Показатели ЛХЛ проб, содержащих изучаемые соединения, выражали вк контрольным значениям. 17812 1 2013.12.30 Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного -критерия, различия считали достоверными при вероятности ошибки 5 . Активность испытуемых соединений и комбинаций оценивали по степени подавления ХЛ, вычисляя эффективные ингибирующие концентрации (16-84) методом 14 с использованием регрессионного анализа в ППП 6.1. Расчет взаимодействия компонентов комбинации выполняли по методу - 14, результат оценивали по значению комбинаторного индекса(9)( ), 1 где- доза (концентрация) агента, оказывающая эффект определенной силы при комбинированном применении- доза (концентрация) агента, оказывающая аналогичный эффект при индивидуальном применении. Значениятрактовали в соответствии со шкалой 0,1 - очень сильный синергизм (5)0,1-0,3 - сильный синергизм (4)0,3-0,7 - синергизм (3)0,7-0,85 - умеренный синергизм (2)0,85-0,90 - слабый синергизм (1)0,90-1,10 - аддитивный эффект (0)1,10-1,20 - слабый антагонизм (1-)1,20-1,45 - умеренный антагонизм (2-)1,45-3,3 - антагонизм (3-)3,3-10,0 - сильный антагонизм (4-)0 - очень сильный антагонизм (5-). Индекс снижения дозыкомпонентов комбинации рассчитывали по формуле( )показывает, во сколько раз можно снизить дозу каждого компонента при их комбинированном применении для достижения того же эффекта, который вызывают компоненты при их индивидуальном применении. Результаты исследования представлены в табл. 2-5. Вещества, входящие в состав заявляемых комбинаций при изолированном воздействии на макрофаги, подавляют оксидантный взрыв (табл. 2). Во всех представленных в таблице комбинаторных сочетаниях активность соединений при их комбинированном воздействии на макрофаги не уступает таковой при индивидуальном, а в ряде случаев существенно превосходит ее. Таблица 2 Активность веществ, входящих в состав заявляемых комбинаций при индивидуальном воздействии на окислительный взрыв макрофагов Соединение-Аргинин Ресвератрол Мелатонин АТФ Инозин АСК СК 17812 1 2013.12.30 Таблица 3 Активность веществ, входящих в состав заявляемых комбинаций при сочетанном воздействии на окислительный взрыв макрофагов Состав комбинации По результатам теста с трипановым синим (0,1 ), заявляемые комбинации не оказывали токсического действия на макрофаги во всем изученном диапазоне концентраций. В табл. 4 и 5 представлены значения комбинаторного индексаи индекса снижения дозыдля синергичных комбинаций -аргинина. Значения комбинаторных индексов , представленные в табл. 4, позволяют классифицировать как очень сильный синергизм взаимодействие -аргинина, АТФ и АСК(1/1/1 и 100/1/10), а также -аргинина, инозина и СК (10/10/1) сильный синергизм взаимодействие -аргинина, инозина и СК (10/1/1), а также -аргинина и АСК (10/1) синергизм - взаимодействие -аргинина с ресвератролом и мелатонином (1000/1/100), с АТФ (10/1), с АТФ и АСК (10/1/1) критериям слабого синергизма соответствует комбинация -аргинина, ресвератрола и мелатонина (100/1/10). 17812 1 2013.12.30 Таблица 4 Значения комбинаторного индексадля синергичных комбинации -аргинина Состав комбинации Примечание к табл.4 и 5. 1 Комбинаторное отношение компонентов (молярное). 16 84- концентрации модулятора, ингибирующие оксидантный взрыв на 1684 по сравнению с контролем (в отсутствие модулятора). 3 Средневзвешенное значение рассчитывается как 30-7033025070/6. 2 17812 1 2013.12.30 Таблица 5 Значения индекса снижения дозыдля компонентов синергичных комбинаций -аргинина Составдля 16 84 2 КОК 1 30-703 комбинации 16 30 50 70 84-аргинин 10 71,3 46,8 30,2 19,5 12,8 36,7 Инозин 1 13,8 13,8 13,8 13,8 13,8 13,8 СК 1 250,0 122,3 58,0 27,5 13,4 85,1 Значения индексов снижения дозы , представленные в табл. 5, свидетельствуют,что для заявляемых комбинаций возможно значительное (в ряде случаев от десятков до тысяч раз) уменьшение доз (концентраций) компонентов при любом уровне эффекта(табл. 5). Применение заявляемых комбинаций приводит к подавлению окислительного взрыва фагоцитов за счет синергичного действия компонентов, что имеет важное биологическое значение, поскольку позволяет управлять одним из ведущих механизмов иммунной реактивности и повреждения при воздействии активированных фагоцитарных клеток на ткани. Таким образом, заявляемые комбинации позволяют решить поставленную задачу. Заявляемые комбинации -аргинина могут быть использованы в качестве лекарственных средств иммуномодулирующего типа действия. 17812 1 2013.12.30 Источники информации 1. Бизунок Н.А. Производные аминокислот - потенциальные модификаторы клеточной продукции оксидантов // Рецепт научно-практический журнал для фармацевтов и врачей. 2006. -3. - С. 28-32. 2.005626883, МПК 01 31/02, 1997. 3..,., -,-// .. - 1990. - . 62. - . 27-58. 4.0077188142, МПК 07 311/00,07 315/00, 2010. 5.. ,. ,. , ,- ( ) // . . . - 1985. - . 37. . 4. - . 449-459. 6. Клиническая фармакология по Гудману и Гилману / Под общ. ред. А.Г.Гилмана. В четырех томах. Книга вторая. - М. Практика, 2006. - С. 557-558. 7. - .// Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9