Вакцина инактивированная для профилактики бешенства и парвовирусного энтерита

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ БЕШЕНСТВА И ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Ковалев Николай Андреевич Гусев Анатолий Алексеевич Бучукури Джемал Владимирович Усеня Михаил Михайлович Красочко Петр Альбинович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56) Каталог лекарственных средств для животных. Торговый дом БИОПРОМ. М., 2004. - С. 188.13935 1, 2010.12751 1, 2009.2366457 1, 2009. КОВАЛЕВ Н.А. и др. Эпизоотология,иммунобиология, фармакология, санитария. - 2011. -1. - С. 19-26. БАБАК В.А. и др. Эпизоотология, иммунобиология, фармакология, санитария. - 2009. -2. - С. 4-9. КОВАЛЕВ Н.А. и др. Экология и животный мир. - 2010. -2. - С. 23-28.(57) Вакцина инактивированная для профилактики бешенства и парвовирусного энтерита у плотоядного, которая содержит культуральную жидкость с инактивированным теотропином в концентрации 0,015 аттенуированным вирусом бешенстваштамма КМИЭВ-94 с инфекционной активностью 6,0-7,550/мл, культуральную жидкость с инактивированным теотропином в концентрации 0,015 аттенуированным вирусом парвовирусного энтерита собакштамма КМИЭВ-14 В с инфекционной активностью 8,0-9,0 2/мл и гидроокись алюминия в качестве адъюванта при следующем соотношении компонентов, мас.культуральная жидкость с инактивированным аттенуированным вирусом бешенстваштамма КМИЭВ-94 47-48 культуральная жидкость с инактивированным аттенуированным вирусом парвовирусного энтерита собакштамма КМИЭВ-14 В 47-48 гидроокись алюминия 4-6. 18504 1 2014.08.30 Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано в биологической промышленности для приготовления вакцины и в ветеринарии для профилактики парвовирусного энтерита и бешенства у плотоядного животного. Известна живая вакцина для профилактики парвовирусного энтерита собак, содержащая штамм парвовирусного энтерита 916 - штаммантиген 1. Это вакцина имеет недостатки, заключающиеся в том, что вакцина является живой и содержит живой вирус, который может вызвать у ослабленных животных парвовирусный энтерит, кроме того, штамм 916 является неспецифичным для территории Республики Беларусь, что затрудняет его использование для конструирования вакцины на территории Беларуси, и он не может быть использован для профилактики данного заболевания. Эти недостатки частично устранены в аттенуированной вакцине Мультикан 8 против парвовирусного энтерита и бешенства, содержащей дополнительно штамм-антиген вируса чумы плотоядных - 103,5 ТЦД 50, штамм-антиген парвовирусного энтерита собак 512 ГАЕ, штамм-антиген аденовируса собак - 104,0 ТЦД 50, штамм-антиген каронавируса собак - 105,0 ТЦД 50, штамм-антиген лептоспиры .-, .- не менее 300 млн кл и штамм-антиген вируса бешенства - не менее 1,0 /см 3, используемой для профилактики чумы плотоядных, парвовирусного энтерита собак, аденовирусного гепатита собак, каронавирусного энтерита плотоядных, лептоспироза и бешенства 2. Данная вакцина имеет недостаток, заключающийся в том, что она является многокомпонентной и при вакцинации ослабленных животных может привести к заболеванию,кроме того, не всегда существует необходимость применить для вакцинации шестикомпонентную вакцину, что может привести к иммунологическим перегрузкам прививаемого животного. Задачей настоящего изобретения является конструирование вакцины, исключающей значительную перегрузку иммунной системы, в которой используются отечественные штаммы-антигены, выделенные на территории Республики Беларусь. Поставленная задача достигается тем, что вакцина инактивированная для профилактики бешенства и парвовирусного энтерита у плотоядного содержит культуральную жидкость с инактивированным теотропином в концентрации 0,015 аттенуированным вирусом бешенстваКМИЭВ-94 с инфекционной активностью 6,0-7,550/мл,культуральную жидкость с инактивированным теотропином в концентрации 0,015 аттенуированным вирусом парвовирусного энтерита собакКМИЭВ-14 В с инфекционной активностью 8,0-9,0 2/мл и гидроокись алюминия в качестве адъюванта при следующем соотношении компонентов, мас.культуральная жидкость с инактивированным аттенуированным вирусом бешенстваКМИЭВ-94 47-48 культуральная жидкость с инактивированным аттенуированным вирусом парвовирусного энтерита собакКМИЭВ-14 В 47-48 гидроокись алюминия 4-6. Поставленная задача достигается за счет использования в заявленных соотношениях в вакцине отечественных специфических для территории Беларуси штамма-антигена парвовирусного энтеритаКМИЭВ-14 В и штамма-антигена бешенстваКМИЭВ-94, обладающих специфической иммуногенностью по сравнению со штаммами аналогичного назначения в прототипе. Кроме того, в заявленной вакцине используется адъювант - гидроокись алюминия, способствующая усилению иммунитета. Характеристика штамма парвовирусного энтерита вируса, штаммантиген КМИЭВ-14 В. Селекционированный, аттенуированный штамм парвовирусного энтеритаКМИЭВ-14 В - штамм-антиген обладает следующими признаками. 2. Патогенность для животных - вирус аттенуирован на культуре клеток, не обладает реверсибельностью, непатогенен для собак, патогенен для щенков. При ведении подкожно в дозе 0,5 см 3 белым мышам не вызывает их гибель. Культурально-морфологические признаки. Вирус размножается в первичной культуре клеток почки собаки, перевиваемой культуре клеток почки кошачьего эмбриона и собачьих перевиваемых клетках. Антигенный состав. Имеет в своем составе - и -гликопротеины, которые индуцируют выработку вируснейтрализующих антител. Определение инфекционной активности. Антигенные свойства. На перевиваемой культуре почки кошачьего эмбриона вирус накапливается в титрах 8,0-9,0 2/мл. Агглютинирует свиные эритроциты. Максимальное накопление вируса происходит в течение 4-9 суток. Иммуногенность - колостральный иммунитет у щенков от животных, привитых инактивированной вакциной, изготовленной из указанного штамма, сохраняется до 12 недель,а иммунитет у привитых собак достигает 6,0 2 на 21 день после двукратной иммунизации. Другие особенности и маркерные свойства. Штамм может ассоциироваться с другими антигенами, депонирован в музее микроорганизмов РУП ИЭВ им. С.Н.Вышелесского, Штамм представляет аттенуированный вирус парвовирусного энтерита. Вирус пассируется при 37 С, лиофилизацию переносит удовлетворительно с одним или с двумя стабилизаторами, инактивируется теотропином, формальдегидом, бета-прорпиолактоном и другими, органическими растворителями, кроме того, вирус можно инактивировать УФ-лучами, сорбируется на адъювантах. Вирус агглютинирует с эритроцитами свиней при 7,2. Производит характерные внутриядерные включения в культуре клеток и характерный ЦПЭ, штамм способен реплицироваться на различных клеточных культурах. Пример 1. Выделение штаммаКМИЭВ-14 В. Полевой вирус парвовирусного энтерита собак был выделен из каловых масс от собаки, больной предположительно парвовирусным энтеритом, для этого делается его 10 ное разведение на питательной среде , добавляется антибиотик 200 г/мл, тщательно перемешивается и центрифугируется при плюс 4-8 С в течение 20 мин. Сливается надосадочная жидкость и хранится при плюс 4 С в течение 16-24 ч. После чего путем внесения посевного материала - надосадочной жидкости - на монослой первичной культуры клеток почки щенка добавляется поддерживающая средав зависимости от объема матраса, инкубируется при 37 С в течение 4-9 дней и замораживается при минус 18-20 С до следующего пассажа. Таким образом делается 5-7 пассажей. После 7 пассажей титр вируса парвовирусного энтерита в РГА (реакция гемагглютинации) со свиными эритроцитами составил 5,0-7,0 2 /мл. Пример 2. Селекционирование штамма парвовирусного энтерита КМИЭВ-14 В. После 5-7 пассажей по методу в примере 1 вируссодержащая жидкость вносится на монослой перевиваемой культуры клеток кошачьей почкии проводится 28-33 последовательных пассажей. На 28 пассаже титр вируса парвовирусного энтерита в РГА (реакция гемагглютинации) со свиными эритроцитами составил 8,0-9,0 2/мл. В результате проведенных операций был селекционирован аттенуированный вирус парвовирусного энтерита собак. Вирус производит характерный цитопатический эффект (ЦПЭ) на монослой перевиваемой культуры клеток кошачьей почкина 4-9 сутки инкубации. 3 18504 1 2014.08.30 Пример 3. Определение инфекционной активности селекционированного вируса парвовирусного энтерита КМИЭВ-14 В. Инфекционную активность указанного штамма проверяли в реакции гемагглютинации(РГА) на пластиковых микропланшетах с -образным дном, где вносили свежую 1 -ную взвесь свиных эритроцитов, в которые добавляли вирус в разведении от 12 до 11024. Реакцию ставили при плюс 4 С в течение 40-60 мин. Реакцию учитывали по агглютинации эритроцитов и титр выражали в 2, который составил 8,0-9,0 2/мл. Пример 4. Определение контаминации бактериями и грибами вируссодержащей жидкости. Сущность метода. Выделение микрофлоры путем инкубирования питательной среды,в которую внесена вакцина. Для проверки селекционированного штамма на контаминацию бактериями и грибами вакцину из 2 флаконов высевают в пробирки с МПА под вазелиновым маслом, агаром Сабуро по 0,5 мл во флаконы с МПБ и МППБ под вазелиновым маслом по 1 мл. Посевы вируса проводят в две пробирки и два флакона с каждой средой. Посевы инкубируют в течение 3 суток, после чего из жидких МПА, МПБ и МППБ питательных сред во флаконах проводят пересев в 2 пробирки с МПА, МПБ и МППБ под вазелиновым маслом. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 суток, а с пересевами - в течение 7 суток при температуре 370,5 С (для агара Сабуро от 20 до 24 С). На питательных средах с посевами вирусного материала роста микрофлоры не должно быть. Условия консервации. Лиофильная сушка вируссодержащей жидкости со стабилизатором - сухое молоко и в защитной среде - гидролизат лактальбумина и не более с 3 влажностью. Способы и условия хранения. Вирус в культуральной жидкости хранится замороженным от минус 70 до минус 86 С или в защитной среде - гидролизат лактальбумина в лиофилизированном состоянии не более 3 влажности при температуре плюс 4-8 С. Жизнеспособность замороженного вируса поддерживается путем пассажа вируса на культуре клетокодин раз в год, а лиофилизированного вируса один раз в 3 года путем пассажа вируса на культуре клеток . Инактивация аттенуированного парвовирусного энтерита собак. Для проведения инактивации парвовирусного энтерита собак в объединенную пробу вируссодержащей жидкости добавляют при постоянном помешивании теотропин в концентрации 0,015 мас.и выдерживают 33 ч при температуре 37 С. Для конструирования заявляемой вакцины вместе со штаммом-антигеном парвовирусного энтерита СКМИЭВ-14 В используется уже выделенный и селекционированный аттенуированный штамм вируса бешенства- штамм-антиген КМИЭВ-94 3. Характеристика штамма-антигенаКМИЭВ-94. Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству , род , РНК-содержащий вирус. Культурально-морфологические признаки. Культивируется на перевиваемых культурах клеток как монослойным, так и суспензионным методом. Максимальное накопление вируса наблюдается на 72-120 ч культивирования. Вирус патогенен для кроликов и белых мышей при интрацеребральном введении. Морфологические признаки. Размер вирионов в среднем от 80 до 120 нм, оболочка вируса имеет шипы 8-10 нм. Антигенные компоненты представлены,и , создающие антирабический иммунитет. Физико-биохимические свойства. Устойчив к холоду,в пределах 4,5-7,8, при температуре плюс 70 С инактивируется мгновенно, инактивируется также солнечными и 4 18504 1 2014.08.30 ультрафиолетовыми лучами, 2-3 -ным раствором , ацетоном, фенолом, формалином, теотропином, консервируется 50 -ным глицерином, нечувствителен к антибиотикам. Молекулярно-биологические признаки. Вирион содержит 5 основных белков. При заражении белых мышей интрацеребрально в дозе 0,03 мл инкубационный период составляет от 4 дней, гибель мышей вызывает на 5-6-7 день. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован. Биологическая активность составляет 6,0-7,550 /мл и выше. Безвредность. Штамм непатогенен для диких плотоядных и собак, полевых грызунов при пероральном введении в 10-кратной дозе. Условия консервации. Лиофильная сушка 10 мозгового материала в защитной среде и не более 3 влажности. Способы и условия хранения. Вирус в культуральной жидкости хранится замороженным от минус 70 до 86 С или 10 мозгового материала в защитной среде в лиофилизированном состоянии и не более 3 влажности, от минус 18 до минус 86 С. Жизнеспособность замороженного вируса поддерживается путем пассажа на культуре клеток один раз в год, а лиофилизированного мозгового материала один раз в 5 лет, через мозг кролика. Пример 5. Определение инфекционной активности вируса до инактивации (титр). Проведение испытания. Вируссодержащую жидкость из двух флаконов смешивают и из смеси готовят десятикратные разведения от 10-1 до 10-8. Для этого в ряд из 8 пробирок наливают по 9,0 мл любой питательной среды. В первую пробирку вносят 1,0 мл вакцины. Чистой пипеткой перемешивают содержимое первой пробирки и 1,0 мл переносят во вторую пробирку и т.д. до конечного разведения 10-8. Каждым разведением вируса, начиная с разведения 10-8 в объеме 0,03 мл, заражают в мозг не менее 4 мышей. Срок наблюдения за мышами 15 дней. Специфической считается гибель мышей не ранее чем на 5 сутки после заражения при наличии типичных признаков заболевания (параличи, парезы, коматозное состояние и др., подтверждается методом РФА). Расчет титра вируса производят по методу Рида и Менча или по Керберу в модификации Ашмарина. Пример 6. Определение контаминации бактериями и грибами накопленного вируса бешенства. Сущность метода. Выделение микрофлоры путем инкубирования питательной среды, в которую внесен вирус. Для проверки селекционированного штамма на контаминацию бактериями и грибами вакцину из двух флаконов высевают в пробирки с МПА под вазелиновым маслом, агаром Сабуро по 0,5 мл во флаконы с МПБ и МГПБ под вазелиновым маслом по 1 мл. Посевы вируса проводят в две пробирки и два флакона с каждой средой. Посевы инкубируют в течение 3 суток, после чего из жидких МПА МПБ и МППБ питательных сред во флаконах проводят пересев в две пробирки с МПА, МПБ и МППБ под вазелиновым маслом для исключения доступа воздуха. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 суток, а с пересевами - в течение 7 суток при температуре 370,5 С (для агара Сабуро от 20 до 24 С). На питательных средах с посевами вирусного материала роста микрофлоры не должно быть. Характеристика инактиванта - теотропина. Теотропин- 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-тетраазациклодекан, порошок белого или желтовато-белого цвета, кисловатого вкуса, без запаха, хорошо растворим в воде, спирте, хлороформе, не растворим в эфире, не летуч. Водные растворы стойкие, при комнатной температуре (18-20 С) сохраняют свое действие в течение 4 месяцев. 5 18504 1 2014.08.30 Теотропин обладает широким спектром вирусоцидного и бактериоцидного действия в отношении грамотрицательных, грамположительных бактерий, включая споровые формы и микоплазмы. Применяется для инактивации вирусов при изготовлении инактивированных вакцин. 4 Характеристика адъюванта - гидроокись алюминия. 1. Общие сведения. 1.1. Алюминия гидрат окиси коллоидный 3 - гидроксал. По внешнему виду представляет собой молочно-белую студенистую массу типа геля без запаха. Массовая доля 3 составляет 6-7 , адсорбционная емкость по казеину не менее 64 , концентрация водородных ионов -6,9-7,5. При длительном хранении гидроксала образуется прозрачная надосадочная жидкость. Хранят препарат в сухом, защищенном от света месте при температуре от 8 до 25 С. Срок годности - 1 год со дня изготовления. Фармакологические свойства. Гидроксал при применении животным внутрь обволакивает стенки слизистой кишечника, обладает также способностью адсорбировать вирусные антигены, токсины в желудочно-кишечном тракте и способствует их выведению из организма 5. Инактивация аттенуированного вируса бешенства Для проведения инактивации вируса бешенства в объединенную пробу вируссодержащей жидкости добавляют при постоянном помешивании теотропин в концентрации 0,015 и выдерживают 33 ч при температуре 37 С. Пример 7. Приготовление вакцины. Способ приготовления вакцины культуральной инактивированной сорбированной для иммунизации собак против бешенства и парвовирусного энтерита. Накопление вируса бешенстваКМИЭВ-94 и парвовирусного энтеритаКМИЭВ-14 В для изготовления вакцины. При изготовлении производственных серий вакцины исходят из расчета, что каждая серия составляет 25-50 тыс. прививочных доз. Для этого необходимо получить 250-500 матрасов вместимостью 1,5 л или 200-400 бутылей вместимостью 2,0 л культуры клетоки ВНК-21. Примерный расчет потребности компонентов для изготовления 25 тыс. доз или 50 л вакцины рабочий раствор Хенкса - 25 л раствор трипсина - 25 л питательная среда Игла - 100 л сыворотка крови крупного рогатого скота - 7 л 7,5 -ный раствор соды - 2,5 л гентамицин - 30,0 г теотропин - 3,0 г инактивированный вирус бешенства, второй компонент посевной вирус - 1,5 л (стационарный метод), 2,0 л (роллерный метод). Титр вируса 9,0-9,5 2/мл и выше. Предварительно выращивают культуру клеток для заражения вирусом. После удаления среды роста в каждый матрас или бутыли с культурой клеток вместимостью 2,0 л вносят посевного материала парвовирусного энтеритаКМИЭВ-14 В в количестве 0,1-0,6 ГАЕ на клетку и равномерным покачиванием распределяют его по поверхности монослоя. После контакта с клетками (60 мин при температуре 37 С) в матрасы добавляют поддерживающую среду Игла в количестве 180-200 мл, в бутыли 200250 мл, -6,7-7,8. Инкубируют емкости при температуре 370,5 С в статичном поло 6 18504 1 2014.08.30 жении (матрасы) или при вращении роллера в пределах 12-15 об/ч (бутыли) в течение 3-7 суток. После наступления цитопатического действия клетки замораживают. Из каждого 20-го матраса (бутыли) делают высевы на бактериальную и микологическую стерильность, после этого их помещают при температуре минус 20-40 С и сохраняют до проведения титрации вируса. Не ранее чем через 16-18 ч после замораживания 2-3 матраса или бутыли с зараженной культурой клеток оттаивают при комнатной температуре и содержимое их смешивают. Из полученной смеси берут пробу в количестве 5-10 мл для титрования вируса путем агглютинации 1 свиных эритроцитов. После чего в полученный объем вируссодержащей жидкости добавляют теотропин 0,015 и инактивируют. Точно таким же образом получают второй компонент - жидкость, содержащую штамм-антиген вируса бешенства КМИЭВ-94, инактивируют и инактивированные компоненты антиген вируса бешенства КМИЭВ-94 и антиген парвовирусного энтерита КМИЭВ 14 В - в соотношении 11 смешивают по 47,992 каждого, добавляют адъювант - гидроокись алюминия 4,001 мас. . Таким образом, использование штамма вируса парвовирусного энтерита собак СКМИЭВ-14 В, обладающего высоким титром - 8,0-9,0 2 /мл (а в прототипе титр равен 6,0-7,0 2/мл) а также штаммаКМИЭВ-94 при конструировании вакцины, обладающей высоким титром, позволяет изготовить высокоиммуногенную,сравнительно дешевую вакцину. Пример 8. Применение заявляемой вакцины. Вакцину применяют для иммунизации щенков и взрослых собак в неблагополучных и угрожаемых по бешенству и парвовирусному энтериту территориях (питомниках). Вакцинации подлежат клинически здоровые животные с 2-3-месячного возраста. Вакцинация щенков включает две инъекции первая - в возрасте 2-3 месяцев вторая - через 20-30 дней после первой вакцинации. Если щенки получены от иммунизированных матерей, их дополнительно ревакцинируют однократно через 6 месяцев, собак других возрастов вакцинируют ежегодно однократно. При применении животным с 2-3-месячного возраста вакцину вводят подкожно в области лопатки или внутримышечно с внутренней поверхности бедра в объеме 2,0 см 3. Собакам мелких и декоративных пород (болонки, таксы, шпицы, терьеры и др.) вакцину вводят подкожно в области лопатки или внутримышечно в области бедра в объеме 1,0 см 3. За иммунизированными животными устанавливают наблюдение в течение 2 месяцев. Прививки проводит ветеринарный врач или фельдшер с соблюдением правил асептики и антисептики. Место инъекции протирают спиртом с объемной долей 70 . Шприцы и иглы стерилизуют кипячением или используют одноразовые. Вакцина безопасна для беременных животных. После применения вакцины иногда возможны реакции гиперчувствительности. В этом случае показано подкожное введение адреналина. О проведенной вакцинации животных составляют акт с указанием даты вакцинации,эпизоотического состояния хозяйства (местности), количества привитых животных, номеров серии и контроля вакцины, наименования предприятия-изготовителя, фамилий лиц,проводивших вакцинацию. Вскрытые, но не использованные флаконы с вакциной подлежат утилизации путем кипячения в течение 15 мин. При проведении вакцинации животных следует соблюдать меры личной гигиены,предъявляемые к работе с биологическими препаратами. 18504 1 2014.08.30 При попадании вакцины на кожу или глаза людей необходимо обильно промыть их теплой водой. После работы тщательно вымыть руки, открытые участки кожи водой с мылом. Источники информации 1.4193991, 1994. 2. Каталог лекарственных средств для животных РОАО Росагробиопром. - М., 2004. С. 188 (прототип). 3.13935, МПК 200961 39/205. 4. Временное наставление по применению Теотропина для дезинфекции в ветеринарии. 07 мая 1998. - Режим доступа /////43. - Дата доступа 20.12.2010. 5. Алюминия гидрат окиси коллоидный (гидроксал). - Режим доступа //. / . - Дата доступа 20.12.2010. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.