Способ получения сыворотки для иммунопрофилактики чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита у плотоядных

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ ЧУМЫ, ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА И АДЕНОВИРУСНОГО ГЕПАТИТА У ПЛОТОЯДНЫХ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Софийская Татьяна Васильевна Финогенов Артем Юрьевич Финогенова Елена Геннадьевна Мистейко Михаил Михайлович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(57) Способ получения сыворотки для иммунопрофилактики чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита у плотоядных, отличающийся тем, что свинью иммунизируют вакциной Биовакчерез каждые 7 дней до достижения в сыворотке крови титра антител 11024 в реакции непрямой гемагглютинации, причем вакцину вводят внутримышечно первые 3 раза по 5 мл, а затем 2 раза по 7 мл, через 2 недели после последнего введения из крови свиньи получают сыворотку, консервируют ее фенолом, который вносят до конечной концентрации 0,05 , выдерживают при температуре 42 С в течение 30-40 дней и подвергают стерилизующей фильтрации. Изобретение относится к ветеринарной эпизоотологии и иммунологии, в частности к применению свиней для получения сыворотки для иммунопрофилактики вирусных болезней плотоядных, а именно чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита. Вирусные заболевания - чума, парвовирусный энтерит и аденовирусный гепатит плотоядных до настоящего времени остаются одними из самых актуальных проблем вирусной патологии плотоядных. Клинически и патологоанатомически эти заболевания характеризуются полиморфизмом признаков. Нередко данные заболевания осложняются вторичной инфекцией, из-за чего возникают сложности при их профилактике и лечении. Профилактика и лечение чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных основаны на использовании препаратов, содержащих специфические антитела сыворотки и глобулины. Известен способ получения иммуноглобулина для иммунопрофилактики и иммунотерапии вирусных болезней плотоядных, а именно чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита, из сыворотки крови лошадей-доноров (выпускаемый АО Биоцентр). 14078 1 2011.02.28 Для получения сыворотки лошадей гипериммунизируют антигенами возбудителей чумы,парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных. Из получаемой сыворотки крови выделяют глобулиновую фракцию 1. Недостаток способа использования лошадей в качестве доноров заключается в том,что сыворотка лошадей обладает повышенной реактогенностью и содержит большое количество чужеродных белков - преципитинов, агглютининов, гемолизинов, что приводит к увеличению риска развития аллергических реакций после применения сыворотки. Известен способ получения сыворотки для иммунопрофилактики и иммунотерапии вирусных болезней плотоядных, а именно чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита, из сыворотки крови собак-доноров. Собак гипериммунизируют поливалентным антигеном, содержащим равные объемы культуральных суспензий штаммовВладимир, инактивированных культуральных суспензий штаммовиГеп. Способ получения сыворотки путем иммунизации собак-доноров включает однократное подкожное введение антигенов в соотношении 11 с полным адъювантом Фрейнда в дозе 1 мл. Через 21 день после введения антигенов проводят тотальное обескровливание собак и получение сыворотки крови,которую затем исследуют на наличие антител против чумы, возбудителя парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита. Сыворотку консервируют 5 раствором карболовой кислоты до конечной концентрации 0,052. Недостаток способа использования собак в качестве доноров заключается в том, что с одного животного получается небольшой выход сыворотки. Кроме того, существует трудность отлова собак, и при гипериммунизации используют штаммы, которые необходимо культивировать, что усложняет процесс производства гипериммунной сыворотки. Известен способ получения сыворотки для иммунопрофилактики и иммунотерапии чумы плотоядных свиней, инокулированных вирусом чумы плотоядных. Свиней инокулируют внутримышечно двукратно с интервалом в 2 недели или четырехкратно с интервалом в 4 недели, или двухкратно с интервалом 4 недели, или трехкратно с интервалом в 1 месяц введением антигена чумы плотоядных штамм ЭПМ, титр 3,5-4,0 ЦПД 50/мл или штамм 668-КФ, титр 2,7-3,5 ЦПД 50/мл, или штамм Шнейдер-Хилл. Каждой свинье вводят по 2 или по 5, или по 1, или по 20 мл антигена. Сыворотку отбирают через 10 дней или через 30 дней, или через 20 дней после последнего введения антигена. После отбора сыворотку фильтруют и консервируют. Титр сывороточных антител определяют в реакции нейтрализации в культуре клеток куриных фибробластов или в культуре клетокс 1000 ЦПД 50 вируса 3. Недостаток данного способа заключается в том, что получается сыворотка для иммунопрофилактики и иммунотерапии только чумы плотоядных, тогда как в начальной стадии клинические признаки чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных схожи и часто не удается провести дифференциальную диагностику, поэтому предпочтительней использовать поливалентную сыворотку против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных. Кроме того, предложеная схема гипериммунизации свиней довольно длительная и занимает 1-4 месяца. Задачей предлагаемого изобретения является получение высокоактивной сыворотки для профилактики чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных и разработка более простого способа ее получения. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения сыворотки для иммунопрофилактики вирусных болезней плотоядных, включающем многократную внутримышечную иммунизацию свиней-доноров антигеном, получение крови от свинейдоноров, отделение сыворотки крови, ее консервацию и фильтрацию, свиней-доноров иммунизируют вакциной Биовак , содержащей в своем составе лиофилизированный живой компонент против чумы плотоядных Биовак , жидкий инактивированный компонент против парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций Биовак , через каждые 7 дней до достижения в сыворотке крови титра антител 11024 в реакции непря 2 14078 1 2011.02.28 мой гемагглютинации, при этом вакцину вводят внутримышечно первые 3 раза по 5 мл, а затем 2 раза по 7 мл, через 2 недели после последнего введения получают сыворотку, консервируют ее фенолом, который вносят до конечной концентрации 0,05 , выдерживают при температуре 42 С в течение 30-40 дней и подвергают стерилизующей фильтрации. Пример 1. Способ получения сыворотки заключается в том, что свиней-доноров гипериммунизируют вакциной Биовак , включающей в себя следующие компоненты лиофилизированный живой компонент против чумы плотоядных Биовак ,жидкий инактивированный компонент против парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций Биовак 4. Вакцину Биоваквводят внутримышечно свиньям-донорам через каждые 7 дней до достижения в сыворотке крови титра антител 11024 в реакции непрямой гемагглютинации, при этом вакцину вводят внутримышечно первые 3 раза по 5 мл, а затем 2 раза по 7 мл. Через 2 недели после последней инъекции производят отбор крови у свиней и помещают кровь на 3 ч в термостат при температуре 361 С. Потом отделяют сформировавшийся сгусток в стерильных условиях от стенок тары и оставляют на 2-3 ч при температуре 18-20 С, а затем на 10-12 ч при 42 С для ретракции сгустка. Образовавшуюся сыворотку центрифугуют при 3000 об/мин 10-15 мин для лучшего отделения сыворотки от клеток крови, потом отцентрифугированную сыворотку охлаждают до 42 С,консервируют ее охлажденным 5 -ным раствором химически чистого фенола до конечной концентрации 0,05 и переливают в стерильные емкости, где сыворотку выдерживают 30-40 дней при температуре 42 С для отстаивания. Потом проводят стерилизующую фильтрацию полученной сыворотки через асбестокартонный фильтр с диаметром пор 0,45-0,50 мм, а затем фильтруют через асбестокартонный фильтр с диаметром пор 0,22-0,27 мм, с одновременной расфасовкой сыворотки в стерильные флаконы емкостью 10, 100 и 250 см 3. Титр антител в готовой сыворотке проверяют в реакции непрямой гемагглютинации(РНГА). Соблюдение указанных параметров технологического цикла способа производства сыворотки обеспечивает получение качественного препарата, предохраняющего восприимчивых животных от заболевания чумой, парвовирусным энтеритом и аденовирусным гепатитом плотоядных, а при возникновении данных заболеваний способствует успешному их лечению. Пример 2. Определение содержания титра антител. Для определения содержания титра антител в сыворотке была поставлена реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Исследовали специфическую сыворотку, взятую от свиней-доноров, и сыворотку против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита собак, выпускаемую НПФ Бионит. В качестве антигена использовали вакцину Биовак . Реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) ставили путем разведения исследуемых сывороток крови в растворителе в лунках планшет микротитратора системы Такачи в объеме 0,025 мл в разведениях от 12 до 14096. После чего в каждую луночку добавляли жидкий ресуспендированный эритроцитарный антиген. Учет реакции осуществляют через 90-120 мин. Контроли эритроцитарный диагностикумположительная сыворотка эритроцитарный диагностикумотрицательная сыворотка эритроциты стабилизированныеположительная сыворотка эритроциты стабилизированныеотрицательная сыворотка эритроциты стабилизированныерастворитель. Положительной считается проба, в которой наблюдается агглютинация эритроцитарного антигена в разведении 18 и выше при интенсивности агглютинации 4, 3, 2. 3 14078 1 2011.02.28 Сомнительной считается проба при агглютинации эритроцитарного диагностикума 12-14. Отрицательной считается реакция при отсутствии агглютинации эритроцитарного диагностикума. Учет реакции полученная нами специфическая сыворотка прореагировала с антигеном в разведении 11024, сыворотка, выпускаемая НПФ Бионит, прореагировала с антигеном в разведении 1512. Пример 3. Определение профилактической эффективности сыворотки. Провели опытное изучение пассивного иммунитета, создаваемого полученной нами от свиней-доноров специфической сывороткой против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных. Для этого было сформировано 6 групп щенков в возрасте от 6 до 12 месяцев, по 3 щенков в каждой. Группы 1, 2, 3 были опытными, а группы 4, 5, 6 - контрольными. Животным опытных групп вводили полученную сыворотку подкожно по 2 мл. Через 3 дня после введения сыворотки животных опытных и контрольных групп заражали патогенными штаммами вирусов 1 и 4 группы - вирусом чумы 2 и 5 группы - парвовирусом 3 и 6 группы - аденовирусом. Наблюдение за животными составляло 4 недели. Результаты опыта показали, что в опытных группах ни одного случая заболевания выявлено не было, тогда как в контрольных группах наблюдалось заболевание собак (таблица). Результаты опыта по экспериментальному заражению собакгруппы Использование сыворотки Заражение Заболело животных 1 опытная Аденовирус 4 контрольная Вирус чумы 3 5 контрольная Парвовирус 2 6 контрольная Аденовирус 2 Таким образом, заявленное изобретение позволяет сконструировать высокоактивную(титр антител в сыворотке против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита составляет 11024), сравнительно дешевую сыворотку за счет того, что в способе ее производства в качестве животных-доноров применяются свиньи, а в качестве антигена используется вакцина Биовак . Предлагаемый способ получения специфической сыворотки для иммунопрофилактики вирусных болезней плотоядных, а именно чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита, основан на использовании в качестве животных-доноров свиней, позволяет получить высокоактивную сыворотку с титром антител в готовой сыворотке в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) к вирусу чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных 11024. Источники информации 1. Патент 2108805, МПК 661 39/42, 39/175, 39/23, 39/29, 39/395, 1998. 2. Патент 2103009, МПК 661 39/42,12 7/00, 1998. 3. Патент 2063767, МПК 661 39/175, 39/395, 39/42, 1996 (прототип). 4. Романов Е.А. Биологические ветеринарные препараты в России Вакцины, сыворотки, диагностикумы Справочник. - Казань Рутен, 2005. - С. 254-256. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4