Поливалентная сыворотка для профилактики или лечения чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных и способ ее получения и применения

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПОЛИВАЛЕНТНАЯ СЫВОРОТКА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ЧУМЫ, ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА И АДЕНОВИРУСНОГО ГЕПАТИТА ПЛОТОЯДНЫХ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(72) Авторы Финогенов Артем Юрьевич Софийская Татьяна Васильевна Мистейко Михаил Михайлович Финогенова Елена Геннадьевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского(57) 1. Поливалентная сыворотка для профилактики или лечения чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных, отличающаяся тем, что содержит антитела к антигенам поливалентной вакцины Биовакв титрах 1512, определяемых по реакции непрямой гемааглютинации. 2. Способ получения поливалентной сыворотки для профилактики или лечения чумы,парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных по п. 1, заключающийся в том, что вводят волу внутримышечно вакцину Биовак 7 раз по 10 мл через каждые 7 дней, через 2 недели после последнего введения осуществляют у вола отбор крови и получают сыворотку, которую консервируют фенолом в конечной концентрации 0,05 , выдерживают при температуре 42 С в течение 30-40 дней и подвергают стерилизующей фильтрации. 3. Способ профилактики чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных, отличающийся тем, что вводят поливалентную сыворотку по п. 1 внутримышечно или подкожно в дозе 2 мл животному массой до 10 кг или в дозе 4 мл животному массой 10 кг или более. Изобретение относится к ветеринарной эпизоотологии и иммунологии, в частности к изготовлению профилактических препаратов против вирусных болезней плотоядных, а именно чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита. Вирусные заболевания - чума, парвовирусный энтерит и аденовирусный гепатит плотоядных до настоящего времени остаются одними из самых актуальных проблем вирусной 13933 1 2010.12.30 патологии плотоядных. Клинически и патологоанатомически эти заболевания характеризуются полиморфизмом признаков. Нередко данные заболевания осложняются вторичной инфекцией, из-за чего возникают сложности при их профилактике и лечении. Профилактика и лечение чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных основана на использовании препаратов, содержащих специфические антитела сывороток и глобулинов. Известна поливалентная сыворотка против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита собак, выпускаемая НПФ Бионит ФГУП Покровский завод биопрепаратов - . Сыворотка содержит антитела против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита собак и изготавливается из крови здоровых лошадей, гипериммунизированных штаммами вирусов чумы, парвовирусных инфекций и гепатита плотоядных. Сыворотку применяют для специфической профилактики и лечения парвовирусного энтерита, аденовирусного гепатита и чумы собак. Сыворотку вводят внутримышечно или подкожно с внутренней поверхности бедра с профилактической целью животным,массой до 5 кг - 3,0 см 3, более 5 кг - 5,0 см 3, с лечебной целью до 5 кг - 6,0 см 3, более 5 кг - 10,0 см 3 1. Сыворотка обладает выраженным терапевтическим эффектом на ранней стадии заболевания. При запоздалом лечении вследствие выраженной иммунологической реакции(воспаление) терапевтический эффект снижается. Известна поливалентная сыворотка для профилактики и лечения чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций плотоядных, содержащая антитела к возбудителям чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций в титрах не менее 164 (в реакции нейтрализации (, 1128 (в реакции торможения гемагглютинации ( и 14(в реакции диффузной преципитации (РДП соответственно, полученная иммунизацией собак поливалентным антигеном, содержащим равные объемы культуральных суспензий штаммовВладимир, инактивированных культуральных суспензий штаммовиГеп 2. Эта сыворотка нередко вызывает аллергическую реакцию, что ведет к низкой эффективности действия при тяжелых формах чумы. Известные способы получения поливалентной сыворотки не позволяют получить заявляемую поливалентную сыворотку ввиду того, что в известных способах используются животные-доноры (лошади, собаки), от которых получается небольшой выход сыворотки или не обеспечивается надлежащая ее эффективность. Известен способ получения поливалентной сыворотки против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных из сыворотки крови лошадей, гипериммунизированных антигеном чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных. Из получаемой сыворотки крови выделяют глобулиновую фракцию, затем ее консервируют и фильтруют 3. Недостаток этого способа заключается в том, что сыворотка лошадей обладает повышенной реактогенностью и содержит большое количество чужеродных белков - преципитинов, агглютининов, гемолизинов, что увиличивает риск развития аллергической реакции после применения сыворотки. Известен способ получения поливалентной сыворотки против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных из сыворотки крови собак-доноров, гипериммунизированных поливалентным антигеном, содержащим равные объемы культуральных суспензий штаммовВладимир, инактивированных культуральных суспензий штаммовиГеп. Способ получения сыворотки путем иммунизации собак-доноров включает однократное подкожное введение антигенов в соотношении 11 с полным адъювантом Фрейнда в дозе 1 мл. Через 21 день после введения антигенов проводят тотальное обескровливание собак и получение 2 13933 1 2010.12.30 сывороток крови, которые затем исследуют на наличие антител против чумы, возбудителя парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита. Сыворотку консервируют 5 раствором карболовой кислоты до конечной концентрации 0,054. Этот способ обладает недостатком, заключающимся в том, что с одного животного получается небольшой выход сыворотки. Кроме того, существует трудность отлова собак и при гипериммунизации используют штаммы, которые необходимо культивировать, что усложняет процесс производства гипериммунной сыворотки. Известные способы применения сывороток не позволяют применять предложенную сыворотку, т.к. существует опасность анафилактического шока. Известен способ применения сыворотки подкожно в дозе 0,05-0,1 мл/мг массы тела животного двух-трехкратно с интервалом 12-24 ч 5. Недостаток этого способа заключается в том, что при тяжелом заболевании животного доза антител, содержащихся в этом объеме сыворотки может оказаться недостаточной. Известен способ применения сыворотки против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных путем внутримышечного или подкожного введения с профилактической целью животным весом до 5 кг - 2,5 см 3 сыворотки, весом более 5 кг 5 см 3. С лечебной целью сыворотку вводят в указанных дозах 1-3 раза с интервалом 12-24 ч в зависимости от тяжести патологического процесса 6. Недостаток этого способа заключается в том, что при повторном введении сыворотки в полном объеме возникает опасность анафилактического шока. Задачей предлагаемого изобретения является конструирование сравнительно дешевой,высокоспецифической сыворотки, обладающей высоким терапевтическим эффектом и разработка более простого способа ее получения и применения. Поставленная задача достигается тем, что поливалентная сыворотка для профилактики или лечения чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных,содержит антитела к антигенам поливалентной вакцины Биовакв титрах 1512,определяемых по реакции непрямой гемаглютинации. Кроме того, поставленная задача достигается тем, что способ получения поливалентной сыворотки для профилактики или лечения чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных заключается в том, что волу вводят внутримышечно вакцину Биовак 7 раз по 10 мл через каждые 7 дней, через 2 недели после последнего введения осуществляют у вола отбор крови и получают сыворотку, которую консервируют фенолом в конечной концентрации 0,05 , выдерживают при температуре 42 С в течение 30-40 дней и подвергают стерилизующей фильтрации. Кроме того, поставленная задача достигается тем, что в способ применения поливалентной сыворотки для профилактики чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных, включает введение поливалентной сыворотки внутримышечно или подкожно в дозе 2 мл животному массой до 10 кг или в дозе 4 мл животному массой 10 кг и более. Полученная поливалентная сыворотка против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных характеризуется следующими показателями. Физико-биохимические свойства поливалентная сыворотка представляет собой сыворотку иммунных волов, по внешнему виду это прозрачная, светло-желтая, иногда с красноватым оттенком жидкость. При длительном хранении на дно флакона может выпасть осадок, который при встряхивании легко разбивается в равномерную взвесь. Безвредность сыворотка безвредна для собак, лисиц, песцов, норок, а также лабораторных животных - кроликов, белых мышей, морских свинок. Активность заявляемая сыворотка должна содержать специфические антитела к вирусу чумы плотоядных, парвовирусному энтериту и аденовирусному гепатиту в титре 1512 в реакции непрямой гемаглютинации (РНГА). 3 13933 1 2010.12.30 Пример 1. Определение содержания титра антител в сыворотке. Для определения содержания титра антител в поливалентной сыворотке была поставлена реакция непрямой гемаглютинации . Исследовали заявляемую поливалентную сыворотку, взятую от волов и сыворотку против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита собак, выпускаемую АО Биоцентр. В качестве антигена использовали вакцину Биовак . Реакцию непрямой гемагглютинацииставили путем разведения исследуемых сывороток крови в растворителе в лунках планшет микротитратора системы Такачи в объеме 0,025 мл в разведениях от 12 до 14096. После чего в каждую луночку добавляли жидкий ресуспендированный эритроцитарный антиген. Учет реакции осуществляют через 90-120 минут. Контроли эритроцитарный диагностикумположительная сыворотка эритроцитарный диагностикумотрицательная сыворотка эритроциты стабилизированныеположительная сыворотка эритроциты стабилизированныеотрицательная сыворотка эритроциты стабилизированныерастворитель. Положительной считается проба, в которой наблюдается агглютинация эритроцитарного антигена, в разведении 18 и выше при интенсивности агглютинации 4, 3, 2. Сомнительной считается проба при агглютинации эритроцитарного диагностикума 12-14. Отрицательной считается реакция при отсутствии агглютинации эритроцитарного диагностикума. Учет реакции полученная нами поливалентная сыворотка прореагировала с антигеном в разведении 1512, сыворотка, выпускаемая АО Биоцентр прореагировала с антигеном в разведении 1256. Хранение сыворотка пригодна для применения в течение 1 года со дня изготовления при условии ее хранения в сухом, темном помещении при температуре 2-4 С. Пример 2. Способ получения сыворотки. Способ получения сыворотки заключается в том, что волов-доноров иммунизируют поливалентным антигеном Биовак 7, включающим в себя следующие компоненты лиофилизированный живой компонент против чумы плотоядных Биовак ,жидкий инактивированный компонент против парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций Биовак РА. Поливалентный антиген Биоваквводят внутримышечно волам-донорам 7 раз по 10 мл через каждые 7 дней. Через 2 недели после последний инъекции производят отбор крови у волов и помещают ее на 3 часа в термостат при температуре 361 С. Потом отделяют сформировавшийся сгусток в стерильных условиях от стенок тары и оставляют на 2-3 часа при температуре 18-20 С, а затем на 10-12 часов при (42) С для ретракции сгустка. Образовавшуюся сыворотку центрифугуют при 3000 об/мин 10-15 мин для лучшего отделения сыворотки от клеток крови, потом отцентрифугированную сыворотку охлаждают до 42 С, консервируют ее охлажденным 5 -ным раствором химически чистого фенола до конечной концентрации 0,05 и переливают в стерильные емкости, где сыворотку выдерживают 30-40 дней при температуре 42 С для отстаивания. Потом проводят стерилизующую фильтрацию полученной сыворотки через асбестокартонный фильтр с диаметром пор 0,45-0,50 мм, а затем фильтруют через асбестокартонный фильтр с диаметром пор 0,22-0,27 мм, с одновременной расфасовкой сыворотки в стерильные флаконы, емкостью 10, 100 и 250 см 3. 13933 1 2010.12.30 Титр антител в готовой сыворотке проверяют в реакции непрямой гемаглютинации(РНГА). Соблюдение указанных параметров технологического цикла способа производства сыворотки обеспечивает получение качественного препарата, предохраняющего восприимчивых животных от заболевания чумой, парвовирусным энтеритом и аденовирусным гепатитом плотоядных, а при возникновении данных заболеваний успешному их лечению. Пример 3. Способ применения сыворотки для профилактики чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных включает внутримышечное или подкожное введение сыворотки в дозе 2 мл животному массой до 10 кг или в дозе 4 мл животному массой 10 кг и более. Соблюдение указанного способа применения сыворотки с профилактической целью обеспечивает отсутствие осложнений при введении сыворотки. Пример 4. Определение профилактической эффективности поливалентной сыворотки. Провели опытное изучение пассивного иммунитета, создаваемого поливалентной сывороткой против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных. Для этого было сформировано 6 групп щенков в возрасте от 6 до 12 месяцев, по 3 щенка в каждой. Группы 1, 2, 3 были опытными, а группы 4, 5, 6 - контрольными. Животным опытных групп вводили поливалентную сыворотку подкожно по 2 мл. Через 3 дня после введения сыворотки животных опытных и контрольных групп заражали патогенными штаммами вирусов 1 и 4 группы - вирусом чумы 2 и 5 группы - парвовирусом 3 и 6 группы - аденовирусом. Наблюдение за животными составляло 4 недели. Результаты опыта показали, что в опытных группах ни одного случая заболевания выявлено не было, тогда как в контрольных группах наблюдалось заболевание собак (таблица). Результаты опыта по экспериментальному заражению собак Использование сыворотки 1 опытная заражение Вирус чумы Парвовирус Аденовирус Вирус чумы Парвовирус Аденовирус Таким образом, заявленное изобретение позволяет сконструировать высокоспецифическую, сравнительно дешевую, предназначенную для широкого круга восприимчивых животных и простую в применении сыворотку за счет того, что в способе ее производства в качестве животных-доноров применяются волы, что позволяет получить выход сыворотки с каждого вола 2-3 литра, в качестве антигена используется поливалентный комплексный антиген Биовак , что позволяет получить сыворотку с титром 1512 в реакции непрямой гемагглютинации, и предложенный способ применения сыворотки позволяет максимально снизить риск развития аллергической реакции. Предлагаемая поливалентная сыворотка против чумы, парвовирусного энтерита и аденовирусного гепатита плотоядных, способ ее получения и применения основаны на использовании в качестве животных-доноров волов, достаточно проста в производстве,что делает ее гораздо дешевле, чем в прототипе. 13933 1 2010.12.30 Источники информации 1. Романов Е.А. Биологические ветеринарные препараты в России вакцины, сыворотки, диагностикумы Справочник. - Казань Рутен, 2005. - С. 372. 2. Патент 2103009, МПК А 61 К 39/42,12 7/00, 1998 (прототип). 3. Патент 2108805, МПК А 61 К 39/42, 39/175, 39/23, 39/29, 39/395, 1998. 4. Патент 2103009, МПК А 61 К 39/42,12 7/00, 1998 (прототип). 5. Патент 2108805, МПК А 61 К 39/42, 39/175, 39/23, 39/29, 39/395, 1998. 6. Патент 2103009, МПК А 61 К 39/42,12 7/00, 1998 (прототип). 7. Биологические ветеринарные препараты в России вакцины, сыворотки, диагностикумы Справочник./Е.А. Романов. - Казань Рутен, 2005. С. 254-256. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6