Штамм гриба Cordyceps militaris – продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной и противоопухолевой активностью

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ ГРИБАПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ,ОБЛАДАЮЩИХ АНТИОКСИДАНТНОЙ И ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Пучкова Татьяна Антоновна Бабицкая Валентина ГригорьевнаБисько Нина Анатольевна Черноок Татьяна ВладимировнаФилимонова Татьяна ВасильевнаСолдатенко Николай Александрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси., 2002. - . 36. - . 127-131..., 2003. . 19. - . 2. - . 428-435.., 2005. - .99. - . 728-738. БАБИЦКАЯ В.Г. и др. Успехи медицинской микологии. Т 2007. - С. 212-214. ПУЧКОВА Т.А. и др. Микробные биотехнологии фундаментальные и прикладные аспекты. Сборник научных трудов. Т.1. - Минск, 2007. - С. 299305.(57) Штамм грибаБИМ -372 Д - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной и противоопухолевой активностью. Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения лечебно-профилактических препаратов, в пищевой промышленности для разработки биологически активных пищевых добавок, в сельском хозяйстве для производства кормовых добавок и касается нового штамма гриба- продуцента полисахаридов и липидов. Биомасса, содержащая большое количество биологически активных полисахаридов и липидов, а также внеклеточные полисахариды могут найти применение в качестве субстанции для получения лечебно-профилактических веществ, усиливающих иммунитет, обладающих антиоксидантной, радиопротекторной, антимикробной, гиполипидемической и др. активностями. Гриб, относящийся к классу аскомицетов, применяется в народной медицине Китая на протяжении 1200 лет и считается универсальным средством для укрепления организма и профилактики различных заболеваний. Соединения, входящие в состав этого лекарственного гриба, улучшают состояние иммунной системы, усиливают резистентность к различным патогенным микроорганизмам, повышают адаптационные возмож 13855 1 2010.12.30 ности организма. Кордицепс также благотворно влияет на нервную, эндокринную, дыхательную и половую системы, обладает антиаритмическим и гипотензивным действием, понижает содержание холестерина, улучшает микроциркуляцию и препятствует тромбообразованию. Биологическую активность этого гриба, наряду с другими соединениями, определяют полисахариды 1. Ресурсы плодовых тел кордицепса в природе ограничены, для создания лечебно-профилактических препаратов используется мицелий,полученный биотехнологическим путем методом твердофазного или погруженного культивирования. Известен биотехнологический способ культивирования, биомасса которого может использоваться в медицине вместо природного(патент 1935979, МПК 12 1/1412 1/14, 2007). Известен состав полусинтетической питательной среды, в состав которой входят глюкоза,цитрат аммония, сульфат магния, витамин В 1, порошок сухого кордицепса, неочищенного риса и вода, обеспечивающий получение биомассы, превосходящей по основным показателям природный кордицепс (патент 1421524, МПК 12 1/1412 1/14, 2003). Известны способы получения комплекса биологически активных веществ из мицелия(патент 101124988, МПК 23 1/28,23 1/09,23 1/30, 23 1/28,23 1/09,23 1/30, 2008), полисахаридсодержащего экстракта мицелия (патент 20030068792, МПК 61 35/78, 2003), внеклеточных полисахаридов (патент 20000038315, МПК 61 35/66,12 1/00,12 1/14, А 61 К 35/66,121/00, 12 1/14, патент 20050004992, МПК 01 1/04,01 1/04, 2005). Для получения мицелия более перспективно погруженное культивирование грибов, которое позволяет за короткий период времени выращивать стандартизированную биомассу с заданными свойствами. Для этой цели необходим поиск штаммов, способных активно расти на жидких питательных средах и синтезировать комплекс биологически активных веществ. Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому результату являются штаммы 18 8,1 9 и 3 10, образующие внеклеточные полисахариды. Штамм 18 выращивают на скошенном картофельно-декстрозном агаре в течение 7 сут., затем на чашках на этой же агаризованной среде 7 сут., потом в колбах на 250 мл при 25 С 7 сут. для получения инокулюма и 10 сут. в 5 л ферментере при 25 С на жидкой питательной среде (состав, г/л глюкоза - 20, 24 - 0,46, 24 - 1,0,47 2 - 0,5, дрожжевой экстракт - 2). Штамм образовывал 11,9 г/л биомассы и 0,886 г/л экзополисахаридов. Штамм 1 выращивают на скошенном картофельно-декстрозном агаре в течение 7 сут., затем на чашках на этой же агаризованной среде 7 сут., потом в колбах на 250 мл на жидкой питательной среде (состав, г/л глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 3, солодовый экстракт - 3, мясной пептон - 5) на роторной качалке при 150 об/мин при 25 С в течение 4 сут. для получения инокулюма и 16 сут. в 5 л ферментере на жидкой питательной среде (состав, г/л сахароза - 40, кукурузный экстракт - 5) при 30 С, исходное значение- 8. Штамм образовывал 22,9 г/л биомассы и 5,0 г/л экзополисахаридов. Штамм 3 выращивают на скошенном картофельно-декстрозном агаре в течение 7 сут., потом в колбах на 250 мл на жидкой питательной среде (состав, г/л глюкоза - 10, дрожжевой экстракт - 3, мясной пептон - 5) на роторной качалке при 150 об/мин при 25 С в течение 4 сут. для получения инокулюма и 15 сут. в 5 л ферментере на жидкой питательной среде, содержащей 30 г/л сахарозы, 10 г/л кукурузного экстракта при 30 С,исходное значение- 8. Штамм образовывал 17,6 г/л биомассы и 3,4 г/л экзополисахаридов 10. После оптимизации питательной среды на 9-10 сут. выращивания в ферментере штамм образовывал 24,16 г/л биомассы и 3,8 г/л экзополисахаридов 11. 2 13855 1 2010.12.30 Штаммы 1 и 3 взяты за прототипы. Недостатками данных штаммов являются длительное выращивание мицелия гриба (26-34 сут.) высокая температура культивирования - 25-30 С использование для роста штаммов дорогих полусинтетических питательных сред. Целью изобретения является получение более продуктивного по синтезу полисахаридов и липидов штамма, способного расти на относительно дешевых и простых по составу питательных средах, обладающего новыми для данного вида гриба свойствами, а также сокращение сроков получения конечного продукта. Новый штаммБИМ -372 Д получен путем направленной селекции быстрорастущих изолятов с повышенным синтезом липидов и полисахаридов из культуры гриба 1862 коллекции культур шляпочных грибов Института ботаники им. Н.Г. Холодного НАН Украины и депонирован в коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Культурально-морфологическая характеристика При культивировании штаммаБИМ -372 Д на чашках Петри с суслоагаром при температуре 20-23 С рост колоний радиальный, центр колоний выпуклый, затем наблюдается зона низкого плотного мицелия, внешний край колонии представлен высоким(4-5 мм) ватообразным мицелием, край колонии ровный. После 14 сут. культивирования наблюдалось значительное замедление роста колоний. При освещении образовывался желтовато-оранжевый пигмент. Гифы мицелия септированные, разветвленные, гиалиновые, с гладкими стенками. Конидиофоры мицелия гиалиновые с гладкими стенками, конидии цилиндрические, гладкостенные, прямые или немного изогнутые с закругленными концами. Образует хламидоспоры. В глубинной культуре на пивном сусле 8 Б рост мицелия дисперсный, пеллеты округлые, размером 0,1-0,6 мм. Физиолого-биохимическая характеристика Штамм .БИМ -372 Д является аэробом, способен расти в интервале температур 15-30 С, оптимальная температура для роста 20-23 С. Оптимальные значения 5,0-7,0. Культура утилизирует моносахариды (арабиноза, галактоза, глюкоза, ксилоза, манноза,фруктоза), дисахариды (лактоза, мальтоза, сахароза, целлобиоза), полиолы (маннит, сорбит,дульцит), полисахариды (крахмал, целлюлоза). В качестве источников азота использует неорганические (3, 43, 4 (4)24) и органические (пептон, кукурузный,дрожжевой экстракт). Штамм не патогенен, токсических метаболитов не образует. Изучение острой токсичности штамма проводили на белых крысах. В рацион вводили зерновой мицелий гриба (0,510 г/кг живой массы) в течение 14 дней. Исследования показали, что за весь период эксперимента клиническое состояние крыс было в пределах физиологической нормы как в опытной, так и в контрольной группах. Прирост живой массы в опытных группах по сравнению с контрольной составил 2,5-9,2 г. По результатам гематологических показателей резких изменений как в контрольной, так и опытной группах не отмечали. По истечении эксперимента от пяти крыс опытных групп получен полноценный приплод, что свидетельствует об отсутствии тератогенного действия гриба на организм животных. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что в исследуемых дозах штамм .БИМ -372 Д не оказывал токсического действия на организм, что свидетельствует о его безвредности. Штамм хранят при 4-6 на сусло-агаре, пересевают 2 раза в год. Установлена стабильность характеристик штамма при хранении в течение 3-х лет. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1. Культуру гриба .БИМ -372 Д выращивают на скошенном суслоагаре при 20-25 С в течение 7 сут., затем переносят в колбы (1 косяк в 1 колбу) вместимостью 0,7 л со 150 мл стерильной среды - пивное неохмеленное сусло 5 Б,5,0-6,0. Штамм культивируют в колбах на качалке (160-180 об/мин) при 20-23 С в течение 5 сут. 3 13855 1 2010.12.30 Выращенный в колбах мицелий стерильно переносят в ферментер объемом 10 л с 7 л питательной среды следующего состава 40 г/л сахарозы, 3 г/л пептона, 2 г/л кукурузного экстракта, 1 г/л 2, 1 г/л 24, 1 г/л 24, 0,25 г/л 4. Культивирование ведется при аэрации 0,5-2,0 л воздуха/л среды/мин, перемешивании 100-150 об/мин, температуре 2023 С. Длительность культивирования - 72 ч. Полученный мицелий фильтруется, промывается водой и сушится в токе теплого воздуха при температуре не выше 60 С. В полученном мицелии и культуральной жидкости определяют содержание эндо- 12 и экзополисахаридов 13, другие показатели (табл. 1, 2). Таблица 1 Биохимический состав мицелия .БИМ -372 Д,выращенного на полусинтетической питательной среде Показатели Биомасса, г/л (АСБ) 23,0-24,5 Эндополисахариды,от АСБ 12,0 Экзополисахариды, г/л 4,0-5,0 Общий белок,от АСБ 25,0-28,0 Общие липиды,от АСБ 11,0-12,0 Фосфолипиды,от АСБ 3,8-4,0 Общие фенольные соединения, мг 980-1100. Таблица 2 Жирнокислотный состав липидов .БИМ -372 Д при глубинном культивировании на полусинтетической питательной среде,от липидов Кислота С 140 сл. С 150 сл. С 160 27,21 С 161 1,65 С 170 сл. С 180 3,26 С 181 40,76 С 182 25,59 С 183 1,53 69,53 1 ненасыщенных 30,47 2 насыщенных 2,28 1/2 Коэффициент ненасыщенности 0,98. Использование предложенного штамма позволило сократить по сравнению с прототипом время культивирования с 26-34 сут. до 15 сут., а также выращивать гриб при более низкой температуре, что позволяет снизить затраты на электроэнергию. У штамма обнаружены новые свойства высокое содержание внутриклеточных полисахаридов - 12,0 липидов - 11,0-12,0 , фосфолипидов - 3,8-4,0 , фенольных соединений 700-750 мг . В жирнокислотном составе липидов преобладают ненасыщенные жирные кислоты, среди которых наибольшее количество олеиновой (С 181) (40,76 ) и линолевой (С 182) (25,59 ). Пример 2. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примере 1. В качестве питательной среды используется комплексная среда следующего состава 20 г/л молочной сыворотки, 30 г/л мелассы, 5 г/л подсолнечного масла. Штамм культивируют в 10 л ферментере в течение 72 ч. В полученном мицелии и культуральной жидкости определяют содержание эндо- и экзополисахаридов, другие показатели (табл. 3). 13855 1 2010.12.30 Биохимический состав мицелия .БИМ -372 Д,выращенного на комплексной питательной среде Показатели Биомасса, г/л (АСБ) 24,2-24,8 Эндополисахариды,от АСБ 12,2-12,5 Экзополисахариды, г/л 4,5-5,0 Общий белок,от АСБ 33,0-35,6 Общие липиды,от АСБ 17,5-22,0 Фосфолипиды,от АСБ 4,8-5,0 Общие фенольные соединения, мг 1000-1200. Данная питательная среда является более дешевой по сравнению с полусинтетической. Выращивание на ней способствует повышению содержания в мицелии белка, липидов,фосфолипидов, общих фенольных соединений, повышается степень ненасыщенности жирных кислот, среди которых значительно преобладает диеновая линолевая кислота (С 182)(55,84 ). Таблица 4 Жирнокислотный состав липидов .БИМ -372 Д при глубинном культивировании на комплексной питательной среде,от липидов Кислота С 140 сл. С 150 0,06 С 160 9,91 С 161 0,04 С 170 сл. С 180 1,08 С 181 33,07 С 182 55,84 88,95 1 ненасыщенных 11,05 2 насыщенных 8,05 1/2 Коэффициент ненасыщенности 1,45. Пример 3. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1, 2. На модели окисления линолевой кислоты установлена высокая антиоксидантная активность глубинного мицелия. Спиртовые экстракты подавляли автоокисление линолевой кислоты и образование продуктов перекисного окисления, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой. За 100 принимали величину антиокислительной активности ионола - известного антиоксиданта. Антиоксидантная активность спиртовых экстрактов мицелия (содержание сухих веществ 0,005-0,01 ) составляла 85-87 по отношению к ионолу (п. 1), 90-92 по отношению к ионолу (п. 2). Пример 4. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1, 2. Противоопухолевое действие биомассы .БИМ -372 Д изучалив семисингенных условиях на взрослых самцах мышей-гибридов (571/6 х /2)1 с перевиваемой солидной Т-клеточной лимфомой Р 388. Лимфому поддерживали в асцитной форме серийными внутрибрюшинными пассажами в сингенных условиях на мышах линии /2. Опухоль прививали в день 0 по 106 клеток под кожу правого бока. Лечение начинали через 72 ч после прививки опухоли. Препарат вводили с помощью зонда внутригастрально ежедневно 1 раз в сут. в течение 10 сут. Суточная доза биомассы составляла 50 мг/кг, биомассу вводили в крахмальном клейстере по 0,25 мл/мышь. Количество мышей в контрольных (интактный контроль и контроль роста опухоли) и экспериментальной группах 5 13855 1 2010.12.30 составляло 8-10 животных. В течение опытов следили за общим состоянием мышей, изменением массы тела, прививаемостью опухоли, динамикой роста опухоли. Расчетную массу опухоли (РМО) высчитывали по формуле М (мг)/2, где М - расчетная масса опухоли, , ,- три наибольших взаимно перпендикулярных диаметра опухолевого узла в мм. Торможение роста опухоли (ТРО) рассчитывали по формуле ТРО(МкМо)/(Мк)х 100, где Мк и Мо - средняя расчетная масса опухоли в контроле роста опухоли и опыте соответственно. Достоверность различий средних значений массы опухоли определяли по -критерию Стьюдента. За достоверные принимали различия при р 0,05. Пероральное введение биомассы гриба, выращенной в условиях глубинного культивирования, приводило к существенному достоверному торможению роста опухоли (табл. 5, фигура). На 14 сут. опыта, т.е. на 2 сут. после окончания лечения торможение роста опухоли составляло 84 . Далее величина ТРО постепенно уменьшалась. Это говорит о том, что применение препаратов на основе биомассы .БИМ -372 Д, скорее всего, должно вестись длительными курсами. Наблюдения за изменением массы тела и общим состоянием мышей не выявили признаков токсического действия биомассы .БИМ -372 Д на лабораторных животных. Таблица 5 Противоопухолевое действие биомассы .БИМ -372 Д Группа животных 12 сут. 14 сут. 18 сут. РМО, мг ТРО,РМО, мг ТРО,РМО, мг ТРО,Контрольные мыши 46 11 132 33 749 111 Опытные мыши 8 4 82 218 84 402170 46 Примечание- средняя расчетная масса опухолистандартная ошибка,- отличия от контроля достоверны при р 0,05. Таким образом, предлагаемый штамм имеет следующие преимущества по сравнению с прототипами (табл. 6). Таблица 6 Сравнительная характеристика предлагаемого нового штаммаБИМ -372 Д и штаммов-прототипов Новый штамм Штаммы - прототипы-Показатель БИМ-372 Д 13 Время культивирования (всего выращива 15 сут. 34 сут. 26 сут. ние мицелия на агаризованной среде (косяки),инокулюма и биомассы в ферментере) Температурный оптимум 20-23 С 25 С 30 С Биомасса 23,0-24,8 г/л 22,9 г/л 24,16 Эндополисахарид 12,2-12,5 г/л Экзополисахарид 4,0-5,0 г/л 5,0 г/л 3,8 Липиды 17,5-22,0 г/л Фенольные соединения 980- 1200 г/л Существенно и то, что у штамма обнаружены новые свойства способность образовывать большое количество внутриклеточных полисахаридов (эндополисахаридов), липидов, фенольных соединений (природных антиоксидантов), антиоксидантная и противоопухолевая активность. Таким образом, предлагаемый штаммБИМ -372 Д превосходит прототипы по ряду показателей. 1) Более высокая скорость роста при погруженном культивировании. 13855 1 2010.12.30 2) Более низкий температурный оптимум (20-23 С), что позволит снизить затраты энергии при выращивании гриба. 3) Высокое содержание в мицелии внутриклеточных полисахаридов (эндополисахаридов). 4) Высокое содержание соединений липидной природы и фенольных соединений. 5) Наличие антиоксидантной и противоопухолевой активности. Источники информации 1..,.-// . - 2008. - . 69. - . 1469-1495. 2. Патент 1935979, МПК 12 1/1412 1/14, 2007. 3. Патент 1421524, МПК 12 1/1412 1/14, 2003. 4. Патент 101124988, МПК 23 1/2823 1/0923 1/3023 1/2823 1/0923 1/30, 2008. 5. Патент 20030068792, МПК 61 35/78, 2003. 6. Патент 20000038315, МПК 61 35/6612 1/0012 1/1461 35/6612 1/0012 1/14, 2000. 7. Патент 20050004992, МПК 01 1/0401 1/04, 2005. 8.-/,, . . //. - 2002. - . 34. - . 56-61. 9.,// .. - 2005. - . 99. - . 728-738 (прототип). 10.3 / , , // . . - 2003. - . 19. . 428-435 (прототип). 11.3 / , , // . . . - 2002. - . 36. - . 127-131 (прототип). 12.,,// . .. - 2000. - . 2. . 51-54. 13., -//о . - 2002. - . 31. . 20-28. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8