Способ активации тканевого активатора плазминогена (его варианты)

1,3 л 0,1 молъ/л трнс/НС 1 (рн 6,6),20 ммоль/л ЕЛКА и 2,5 тритои-Х-100 и гомогениэируют. После повторного центрифугирования (30 мин для 27000 3, д 9) гранулы вводят в 1,3 л 0,1 ноль/л трио НС 1 (рн 6,5),,20 молъ/л ЕДТА и 0,5 тритон-Х-100 И ГОМОГВННЭНРУЮТЫ ЧЕРЕЦОВЭННЕ Цен трифугирования (30 миидля 27000 в,дС) и гоногеннзациъд гранул в 1 л 0,1 моль/л трис/НС 1 (рн 6,5) н20 ммолв/л ЕДТА проводят еще тридЫСодержание ЕРА гегас 11 е Ъо 1 е 5 определяют по БПЗ-РАЕ, идентификации ЕРА-полос по ПевЕ 1 гпЬ 1 о 1 п 3 деиситометрическим анализом КеЕгас 11 е ъоа 1 ез по 5 В 5 РАсЕ иИеас 1 гпЬ 1 оЕЬпв. 7 -Анализ показывает плотную сРАполосу с мол, весом около 60 кДт Доля ЕРА в общем содержании протеина геЕтасс 11 е Ьодтев составляет около 21.Белок инкубируют при концентргг ции 1-5 Мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС 1(рн 8,6), 6 мол/л гуандингидрохлорида 0,15-0,4 молъ/л ДТЕ И 1 ммол/л ЕДТА в течение 2-3 ч при комнатной температуре, Затем нерастворенный материал (фрагменты стенок клеток и т.п.) отделяют центрифугированием(30 мин для 35000-50000 3., 40 С). Величину рН надосадочиой жидкости устанавливают КОНЦЕНТРИРОБЗННОЙ СОНЯ ной кислотой до рН 3. денатурируюшее 1 средство и восстановитель отделяют 5 диализом против 0,01 моль/Л НС 1 при 4 С. 0,5 моль/л Ь-аргинина, 2 ммол/л ови, 0,2 ммолъ/л овес. После 17-2 д ч активации при 2000 определяют активность в сравнени с актиностью естественного гликолиэированного ЕРА из эвкарионтов. Выиод готового продукта в пересчете на общее содержание протеина 2,513 0,5, стнъяулируемость 10 Е 5.Выиод готовогопродУКТа В пересче те на количество сРА примерно 12 5г) Повторное окисление/актиация без отделения денатурирующее средство/восстановительБелок инКУбнруют при концентрации 1,25 мг/мл в 0,1 моль/л трис/НС 1(рН 8,6), 6 ммолп гУаниднгидро хлорида, 0.2 молъ/л ДТЕ и 1 моль/л ЕЛКА в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем сразу же проводят повторное окисление 15100 разбавлением в 0,1 моль/лтрис/НС 1 (рН 10,5), Р 1 шаль/л ЕДТА. 1 мг/ил ВБА,О,З моль/н. Ъаргинина и в указанных в табл. 1 п количествах С 5 БС Дополнительно в активИРУЮЩей добавка находится остаточная концентрация 0,06 ноль/л гуанидингирохлорида и 2 ммол/л ДТЕЗависимость выхода актиации от С 55 Сконцентрации при активации безотделения денатурирующее средство восстановител показана в табл, 1.рида и 0,15-0,2 молъ/л ДТЕ в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Не растворенный материал (фрагменты стенок клеток и тпд-) отделяют центрифугированием (20 мин при 17000 3). Денатурируюшее средство и восстановитель удаляют гелевой фильтрацией через Зеръадех С. 25 в 0,01 молъ/л НС 1. При этом проба разбавляется на коэффициент 5-10, Восстановленный материал растворяют в 0,01 мол/л НС 1 при -2 ОСВыход активного ЕРА в пересчетеДЕНО влияние РЗЗПНЧНЬП ПВРМЕТРО на актиацию и стимулируемость ЬРА. для ЭкспгРНМеНт 8 повторного окисления восстановлении протеин, растаереннй по прииеру 2, балше.не очнч Восстановленный протеин (01 А 0,01 мопъ/п НС 1) активируют растворением 110 5 1500 в буфере повторного окнсленип.,Актишацшо определя- ют после 22-48 ч.ииубацни при комнатной тенпературе. Актиация окисленного повторно протеина по отноше иию к стандартному повторному окис пейию (100) в 0,1 молъ/л трис/НС 1(рН 10,5) 1 мысль/л ЕДТА, 0,5 мо.пъ/л Ьаргинииа, 1 мг/мл ВЗА, 0,5 мол/л СЗН (восстановленный глютатион),0,5 моль/л 0530 (дисупъфид глютатиона). . 1. Зависмость выхода активации от добавки Ь-аргинина или гуанидингидрохпорнда. .Зависимость выхода активации от КОНЦВНТРЗЦНН РЗРГННННЗ ПРЕДСТЕВЛЕ нав таби. 2.- 2 . Зависимость активации от добавкиЗависмостъ актиацииот добавки мочевины следующаяМочерина Активность,5 моль/л Х 1 1 . 59 1.5 126 2 1 162 2,5 141 5 1 з 22 4 12 Зависмость актиации от добавни нетилочевины Метипочевина Активность,15 моиъ/п . 2 0,5 . 22 1 174. 1,5 313 29 2 375 2,5 332 З 215 Зависмость активации от добавки этимочевины 25 Этилмочевииа Активность,моль/л 2 0,5 46 1 - 212. 30 1,5 323 2 - 300 2,5 107Зависимость активации от добавки диметнлмочевины представлена в3. Зависимостн актиности от добавки амидов жирных кислот. 0 - Повторное окисление в 0,1 мол/л 55 трис/НС 1 (рн 10,5 1 ммолъ/л ЕДТА 1 мг/мпВ 5 А,5 нноль/лС 5 Н 0,2 ммоль/л 0550. ЗависностЬ актиации-от добавокФоркамнщ Активность,нолл 0,5 59 1 . 175 1,5 245 2 325 2,5 423 З 444 4 1416 . 5 .34 Зависимость актндцйи от добавок нетилфорамида Метилформамид, Актнность,моль/л . 0,5 100 1 135 1,5 3 О 4- 2 389 г. 2,5 466 3 1452 4 425 5 121 Завнсиость активации от добавок ацетамида - Ацетамид Актиноеть,- молъ/л 2 05 . 72 1 134 15 . 207 2 261 2,5 204 З - 237 4 198 5 141 Зависимостъ актиацнм от добавок пропионамнда Пропионамищ Актиность,ноль/п Ж 0,5 95 1 99 1,5 . 197 2 150 25 101 з 39 4 2 Завсиость актиаци от добавок бутнрамнда Бутирамид Актиностъот величины рНПовторное окисление В 0,1 МОЛ/ЛЗависимостъ актиностиот величины рн представпенав табл.45 . Т а б л и ц а 4 рн Активностъ СтиУлируемость 10 . 1 (Коэффициент)5. Зависимость вьпхпда активйости от СБН/8586 конентрацни.Зависиость актиности рт концент 25 рацин СБН представлена в табл 5.40 5) о,2 мол/л сзвс. зависимость дктивностиот концент рации 0556 представлена в табл 6.Использование ген-весне Ьодйев, 5 Воопроизводшость резудпьтатъв полученных по одному из предыдущъп г-ективвци сРА.Б 5 С представлена в прмерон.Восстановлене геЕгаес 11 е табл. 8. ъоайеа проведено за 2 ч иъпсуовщш ,анъдоднатной температуре в 0,1 моль/л , трисчс 1 (рн в,в), 1 молд идм, , -- 6 моль/л сад 1101, 0,2 моль/л ДТЕ при Опыт р и Вьвсод, Х Стшугшруе-кконцентрации протеина около 1 Мг/мл, Нестьч После подкисления концентрированч 5 3,45 17,2ной соляной кислотой до рН 3 проводят до 6 4,32 8,3 диализ о.о 1 мол/п нс 1 при.дС. Пос- 7 3,29 14,0ле диализа общая концентрация протеи- 8 3,511 13,4 ина.составляет 0,35 мг/мл, Таки об 9 5,07 16,4риментах по оптимизации условной ре- .активации, не применяют 6556 н вк в) Стабильность актиъированного тиацю проводят через 17 ч путем - протенна. . резбавления в 0,1 мол/л ррнс, 30 Активеци проводят в 1200 раз 1 ммоль/лЕдША,.0,5 моль/л Ъ-аргини- Бавленни в 0,1 мол/л трнс/НС 1, на, 1 мг/мл ВЗА н 1 ммолъ/п СБН при 1 ммол/л ЕЦТА, 0,5 мол/л Ъ-аргиизменении величины рн (табл, 7), - ннна, 1 мг/мп ВЗА н 2 топь/л (1311.данные о стабнлности активиро Т ап и ц а 7 ВЗННОГО протеина ПРИВЕДЕНЫ В-Р- 50 П р и не р 5 Активация полученвыодгтдвого дрддукта Ьпреде- ного генной технологией интерферолен по проценту активности сРА в -Н-д- пересчете на введенное количество Восстановление/РЗСТВОРЕННС ПРОВ 0 протеина дят следующим обрзон осадок ину б) Воспроизводимость результатов . 55 бируют 3.чпри 25 С в 10 мл 9.1 ноль/л актиации РА 8 С. . тР/НС 1 (Рн 3-5) 5 МОЛЪ/П 54 нС 1 Все данные активации суши-крут 1 1 ИШЬ/П ЕдТд И 02 НОЛЬ/П дТЕ и деде 1,100 т, 1,200 разбавления ловле 30 мин дентрх-кругированин при