Аттенуированный штамм вируса диареи крупного рогатого скота Bovine viral diarrhoea КМИЭВ – V120 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТАКМИЭВ - 120 ШТАММ-АНТИГЕН(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Красочко Ирина Александровна Ломако Юрий Васильевич Яромчик Ярослав Петрович Борисовец Дмитрий Сергеевич Дубаневич Олеся Валентиновна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)26676 , 2007. ГЛОТОВ А.Г. и др. Вопросы вирусологии. - 2006 -1. - С. 42-45. КРАСОЧКО П. А. и др. Эпизоотология, иммунобиология, фармакология,санитария. - 2009. -2. - С. 74-78. КОТ Н.И. Иммунопрофилактика заболеваний, вызванных вирусами инфекционного ринотрахеита, диареи и парагриппа-3 крупного рогатого скота Автореф. дис. - Минск, 2003. - С. 12-13. СИДИБЕ ШАРЛЬ ЭМИЛЬ КАЛИЛУ. Влияние типа культуры клеток и штамма вирус на антигенную активность инактивированной ассоциированной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота Автореф. дис. М., 1995. - С. 1-17.10696 2, 2008.(57) Аттенуированный штамм вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамм-антиген. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, а также к биотехнологии и может быть использовано при конструировании биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения вирусной диареи крупного рогатого скота. Вирусная диарея крупного рогатого скота (болезнь слизистых оболочек) - контагиозная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, эрозийно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта и дыхательных путей, сопровождающаяся диареей,ринитом, конъюнктивитом. В настоящее время известен ряд штаммов вируса диареи, используемых для изготовления вакцинных и диагностических биопрепаратов. Известен штамм вируса диареи-24, который использован для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Данный штамм был адаптирован в 1969 г. к диплоидной культуре почки свиньи (линии РК-12-15), почки хомяка (линия НАК), чело 18415 1 2014.08.30 веческим клеткам -1, клеткам носовых раковин, к перевиваемым линиям ,ППЭК, почки овцы и др. Цитопатическое действие (ЦПД), вызываемое шт.-24, начинается через 1648 ч (в зависимости от типа культуры клеток) и достигает максимума на 3-4-е сутки после заражения. Оно проявляется мелкозернистой инфильтрацией в клетках фибробластного типа, вакуолизацией в перинуклеарной зоне. Сроки развития цитопатических изменений не соответствуют увеличению титра вируса. К 72-96 ч после инокуляции, когда инфекционный титр вируса достигает максимума 5,5-6,5 ТЦД 50/мл, в первичной культуре тестикул отмечают лишь начало ЦПД 1. Инфекционный титр вируса - это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Недостатком известного штамма является его низкая биологическая активность, титры вируса достигают 5,5-6,5 ТЦД 50/мл, что является недостаточным для конструирования инактивированных вакцин. Известен цитопатогенный штамм вируса-,-340, депонированный в НИИ Коллекция культур микроорганизмов ГНЦ ВБ Вектор под номером 0604, который используют для изучения клиники вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота. Для экспериментального воспроизведения вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота - у телят суспензию штамма вируса вводят в дозе 4 мл серонегативным к вирусу телятам 3-4-месячного возраста при помощи аэрозольного генератора БГ-2 2. Недостатком известного штамма является то, что его применяют для изучения клиники вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота. Данный штамм не является аттенуированным, вызывает развитие клинических признаков болезни и поэтому не может быть использован для изготовления вакцины против вирусной диареи болезни слизистых крупного рогатого скота. Известен штамм вируса диареи крупного рогатого скота ВК - 1 28, который выделен из селезенки больного теленка, депонирован во Всесоюзном государственном научноконтрольном институте ветпрепаратов под 28. Данный штамм предназначается для изготовления живой вирус-вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота и эритроцитарного диагностикума. Для сенсибилизации эритроцитов при изготовлении эритроцитарного диагностикума штамм вируса диареи крупного рогатого скота ВК-128 используют в титре 5,5-6,5 ТЦД 50/мл. Вируссодержащую жидкость получают путем накопления вируса в первично-трипсинизированной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) или ее субкультуре (СПЭК) 3. Недостатком данного штамма является его низкая доминантность над эпизоотическими штаммами, а также низкая биологическая активность (инфекционный титр вируса 5,56,5 ТЦД 50/мл), что является недостаточным для конструирования инактивированных вакцин. За прототип взят штамм вируса диареиКМИЭВ-7 крупного рогатого скота для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Штамм вируса диареиКМИЭВ-7 крупного рогатого скота характеризуется следующими признаками и свойствами. Назначение. Штамм вируса диареиКМИЭВ-7 крупного рогатого скота используется для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. Культурально-морфологические свойства. РНК-содержащий вирус, вирионы диаметром 30-50 нм, чувствителен к эфиру, хлороформу, колебаниям среды с величинойот 3 до 9, на поверхности имеет выступы. Наиболее стойкий при 7,4, цитопатическое действие (ЦПД) наступает через 24-48 ч после инокуляции и характеризуется округлением клеток, зернистостью, разрушением монослоя. 2 18415 1 2014.08.30 Антигенная активность. Вирус вызывает выработку вируснейтрализующих антител у телят и кроликов при парентеральном введении. Стабильность основных признаков штамма при длительном хранении. Штамм сохраняет свои особенности и признаки при выращивании на питательной среде - гидролизате. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Безвредность. Не патогенен для телят и лабораторных животных. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Основные условия хранения. ШтаммКМИЭВ-7 крупного рогатого скота хранится в замороженном сотоянии при температуре 20 С и ниже или в лиофилизированном при температуре 4 С. Поддержание штамма. Проводят методом субкультивирования на перевиваемой линии , ПТ или первичной культуре клеток ПЭК. Для культивирования вируса используется питательная среда - 5 -ный гемогидролизат 4. Недостатком данного штамма является то, что он характеризуется сравнительно невысокой биологической и антигенной активностью инфекционный титр данного штамма достигает 5,5-7,5 ТЦД 50/см 3, а антигенная активность через 21 день после его введения телятам составила в РНГА 1128, следовательно, вакцина, сконструированная с использованием данного штамма, будет отличаться более низкой профилактической и иммунологической эффективностью при проведении специфической профилактики вирусной диареи крупного рогатого скота. В связи с этим актуальной остается проблема поиска новых высокоиммуногенных аттенуированных штаммов вируса диареи для производства эффективных средств диагностики, специфической профилактики и лечения вирусной диареи крупного рогатого скота. Задачей настоящего изобретения стало получение нового производственного аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скота, обладающего высокой биологической, антигенной, иммуногенной активностью и высокой доминантностью над эпизоотическими штаммами. Поставленная задача достигается тем, что выделен штамм вируса диареи крупного рогатого скота- штамм-антиген - на первичной культуре клеток почки эмбриона коровы ПЭК от теленка 3,5-месячного возраста, павшего с клиническими признаками вирусной диареи, и аттенуирован путем длительного культивирования на первичной культуре клеток ПЭК и перевиваемых культурах клеток ПТ и . Аттенуированный штамм вируса диареи крупного рогатого скота - штамм-антиген - депонирован в коллекции РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского и ему присвоен регистрационный номер КМИЭВ - 120. Характеристика аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена. Таксономическая принадлежность. РНК-геномный вирус, входящий в семейство, род , вид. Культурально-морфологические свойства РНК-содержащий вирус, вирионы диаметром 35-55 нм. Вирионы имеют плавучую плотность 1,12 г/см 3, коэффициент седиментации 13811. На тонких срезах обнаруживают гладкую двухслойную оболочку и сферический нуклеокапсид диаметром 20-30 нм. Вирионная РНК имеет молекулярную массу 3,22 МД и коэффициент седиментации 38. Структурные белки представлены тремя полипептидами с молекулярной массой 57, 44 и 34 кД, из которых первых два гликозилированы (57 и 44). При культивировании на культурах клеток ЦПД наступает через 24-48 ч после инокуляции и характеризуется округлением клеток, отслоением монослоя. Среднее значение титра инфекционной активности в культурах клеток составляет 6,08,0 ТЦД 50/мл. 3 18415 1 2014.08.30 Физико-химические свойства. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, колебаниям среды с величинойот 3,0 до 9,0. Наиболее устойчивый при 7,4. Вирус не чувствителен к антибиотикам. Онкогенность. Вирус не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой. Биотехнологическая характеристика. Вирус размножается в перевиваемых культурах клетоки ПТ, первичной культуре клеток ПЭК со средним значением титра инфекционной активности 6,0-8,0 ТЦД 50/мл при соблюдении следующих параметров множественность заражения 0,01-1,0 ТЦД 50/кл, питательная среда среда Игла и среда 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Время культивирования 24-48 ч. Установленный температурный режим - 37 С, при 6,7-8,0. Стабильность. Штамм сохраняет свои свойства при выращивании на питательной среде Игла и среде 199 с добавлением 2 -ной сыворотки крови крупного рогатого скота. Антигенная активность. Уровень специфических антител к аттенуированному штамму вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штаммуантигену - в сыворотках крови телят в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) составляет 1256. Иммуногенность. При вакцинации телят, кроликов и белых мышей инактивированной вакциной, сконструированной на основе аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена - титр вируснейтрализующих антител составляет в среднем 8,00,2 2 (в РНГА), 6,50,3 2 и 4,40,24 2 (в реакции нейтрализации (РН соответственно. Безвредность. Аттенуированный штамм вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамм-антиген - не патогенен для телят и лабораторных животных. Сведения о криоконсервации. Аттенуированный штамм вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамм-антиген - хранится в замороженном состоянии при температуре -20 С и ниже или в лиофилизированном виде - при 24 С. Таким образом, поставленная задача достигается за счет того, что предлагаемый нами штамм имеет более высокую биологическую и антигенную активность по сравнению с прототипом. Так, инфекционный титр аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена - на культурах клеток достигает 6,0-8,0 ТЦД 50/см 3, тогда как у прототипа - 5,5-7,5 ТЦД 50/см 3, антигенная активность заявляемого штамма через 21 день после его введения телятам составила 1256 в РНГА, тогда как в прототипе данный показатель был ниже и составил 1128, что позволяет достичь поставленной задачи. Пример 1. Выделение штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена. Материалом для выделения штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена - послужила селезенка от теленка возрастом 3,5 месяца, павшего с клиническими признаками вирусной диареи. Выделение штамма осуществлено на первичной культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) путем 3-х слепых пассажей и идентификацией после получения характерного для вируса ЦПД со специфической гипериммунной сывороткой в реакции нейтрализации. Пример 2. Аттенуация штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена. Для снижения патогенности и сохранения антигенности проведено пассирование вируса на культуре клеток по следующей схеме 4 18415 1 2014.08.30 5 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК 10 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток . Пример 3. Культивирование аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена. Выращивают перевиваемую культуру клетокв течение 2-3-х суток при температуре 37 С на питательной среде, состоящей в объеме 45-47 из среды Игла, 45-47 среды 199 и 6-10- сыворотки крови крупного рогатого скота, которую заражают аттенуированным штаммом вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штаммом-антигеном - с инфекционным титром - 6,0-8,0 ТЦД 50/мл в дозе 5-6 мл на матрас (10-20 вирусных единиц на клетку) или 4-5 мл на роллер и культивируют в течение 24-48 ч при температуре 37 С при 6,8-8,0 в поддерживающей среде, состоящей в объеме 48-49 из среды Игла, 48-49- среды 199 и 2-4- сыворотки крови крупного рогатого скота, определяют микроскопическим визуальным методом наличие разрушения монослоя под действием аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена - в сравнении с контролем, затем матрасы или роллеры с полученным аттенуированным штаммом вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штаммомантигеном - подвергают замораживанию при температуре 20 С на 24 ч, после чего их размораживают при температуре 37 С в течение 2-4 ч и титруют на культуре клеток. Инфекционный титр аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена - после титрации на культуре клетокпо методу Рида и Менча составляет 6,0-8,0 ТЦД 50/см 3. Пример 4. Определение инфекционной активности аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена. Инфекционный титр аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена - определяют по методу Рида и Менча. Контроль инфекционной активности аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штаммаантигена - после проведения пассажей проводят на различных культурах клеток (табл. 1). Таблица 1 Инфекционная активность аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 штамма-антигена ( ТЦД 50/мл) Культура клеток 1-й пассаж 5-й пассаж 10-й пассаж 20-й пассаж ПЭК 3,20,2 6,00 ПТ (линия Таурус) 4,20,2 6,00 6,20,2 5,60,4 6,20,2 6,70,4 8,00 Пример 4. Определение иммуногенной (антигенной) активности аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 штамма-антигена. Для контроля иммуногенной (антигенной) активности аттенуированный штамм вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штаммантиген - с инфекционным титром 6,5 ТЦД 50/мл после проведения пассажей на различных культурах клеток вводят кроликам по 5,0 см 3 внутримышечно двукратно с интервалом 14 дней. Наличие антител в сыворотке крови определяют через 14 суток после вторичной вакцинации в реакции нейтрализации (табл. 2). Проводят заражение 5 телят аттенуированным штаммом вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамм-антиген, который получен 5 18415 1 2014.08.30 путем длительного культивирования на различных культурах клеток на первом этапе 10 пассажей на первичной культуре клеток ПЭК, затем 15 пассажей на перевиваемой культуре клеток ПТ (линия Таурус) и 20 пассажей на перевиваемой культуре клеток. У животных, получавших адаптированный вирус, не должно быть отмечено повышения температуры тела, энтеритов, воспаления органов дыхания. У телят через 21 день после введения аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена - должна отмечаться выработка противовирусных антител в титре не ниже 1256 в РНГА. Таблица 2 Иммуногенная (антигенная) активность аттенуированного штамма вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамма-антигена после проведения пассажей на различных культурах клеток (2) Культура клеток ПЭК ПТ (линия Таурус) Таким образом, аттенуированный штамм вируса диареи крупного рогатого скотаКМИЭВ - 120 - штамм-антиген - выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому имеет схожую антигенную структуру с циркулирующими эпизоотическими штаммами, кроме того, заявляемый штамм обладает более высокой биологической активностью по сравнению с прототипом - 6,0-8,0 ТЦД 50/см 3 (у прототипа - 5,5-7,5 ТЦД 50/см 3), антигенной активностью - 1256 в РНГА (у прототипа 1128) и может быть использован для конструирования диагностических и профилактических препаратов. Источники информации 1. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных / Под ред. В.Н.Сюрина. - М. Всерос. науч.-исслед. и технол. ин-т биол. пром-сти, 1998. - С. 145. 2. Патент 2315100, МПК 612 7/00, 2008. 3. Патент 1835659, МПК 661 39/15,01 33/556, 1996. 4. Патент 26676, МПК 661 39/265,12 7/00, 2007 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6