Способ иммунохимического количественного определения тирогормона, выбранного из свободного Т3 и свободного Т4

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИРОГОРМОНА, ВЫБРАННОГО ИЗ СВОБОДНОГО Т 3 И СВОБОДНОГО Т 4(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Новаковский Максим Евгеньевич Вашкевич Ирина Игнатьевна Свиридов Олег Васильевич Жоров Олег Васильевич Кузуб Наталья Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ иммунохимического количественного определения тирогормона, выбранного из свободного 3 и свободного 4, заключающийся в том, что смешивают биотинсвязывающий белок, иммобилизованный на твердом носителе, с пробой анализируемого образца, а также с калибровочными пробами, содержащими различные концентрации тирогормона,во все пробы вносят меченые антитела к тирогормону, инкубируют в течение 30-60 минут,вносят конъюгат соответствующего тирогормона с биотином, инкубируют в течение 10-15 минут, проводят разделение свободной и иммобилизованной форм меченых антител к тирогормону, измеряют интенсивность сигнала иммобилизованной формы меченых антител и по графику зависимости интенсивности сигнала от концентрации тирогормона,построенному с использованием калибровочных проб, определяют количество тирогормона в анализируемом образце. Изобретение относится к областям медицины, биохимии и фармацевтической химии, а именно к иммунохимическому анализу свободных гормонов щитовидной железы (тирогормонов) - 3,3,5-трийодтиронина (трийодтиронин, 3) и 3,3,5,5-тетрайодтиронина(тироксин, 4) в сыворотке крови человека, фармацевтических субстанциях и готовых лекарственных препаратах. Известны различные способы иммунохимического анализа содержания тирогормонов в сыворотке крови и других физиологических жидкостях, биологических и фармацевтических образцах с использованием изотопных, ферментных или люминесцентных меток. Однако они не отличаются разнообразием. Как правило, используются твердая фаза (пробирки, планшеты, шарики и т.п.), покрытая специфичными антителами к 3 (анти-3) или специфичными антителами к 4 (анти-4), и модифицированный радиоактивной или не 13850 1 2010.12.30 изотопной меткой тирогормон или его аналог, который конкурирует с определяемым 3 или 4 в составе анализируемого образца за связывание с антителами, иммобилизованными на твердой фазе 1-5. Недостатки таких тест-систем повышенный расход дорогостоящих подобранных антител для покрытия твердого носителя вероятность систематической ошибки при использовании для иммуноанализа свободных тирогормонов в сыворотке крови человека 6. Известен другой распространенный способ определения тирогормонов. Твердая фаза покрыта высокомолекулярным производным 3 или 4 (например, конъюгат тирогормона с инертным белком), которое конкурирует с 3 или 4 анализируемого образца за связывание с анти-3 или анти-4, модифицированными радиоактивной или неизотопной меткой 7, 8. Недостаток требуется получение высокомолекулярных конъюгатов тирогормонов,которые, как правило, отличаются сильной вариацией свойств, нестабильностью и сложностью в применении. Запатентованы другие способы определения содержания тирогормонов в биологических образцах 9-11. Среди них наиболее близким к заявляемому является способ определения количества тирогормонов, в том числе свободных 3 и 4, в присутствии тирогормон-связывающих белков, в котором используются твердая фаза, покрытая антителами против иммуноглобулинов класса(компонент 1), конъюгат тирогормона с(компонент 2), обладающий сродством к антителам на твердой фазе посредством своей белковой части, и меченые флуоресцентным соединением или радиоактивным изотопом антитела против тирогормона, не имеющие сродства к иммобилизованным антителам(компонент 3) 10 (прототип). На первой стадии компонент 2, компонент 3 и анализируемый образец сыворотки крови, содержащий свободный тирогормон, одновременно вносят в формованное изделие (пробирка, микропланшет), внутренняя поверхность которого покрыта компонентом 1. В процессе инкубации происходит конкурентное связывание компонента 3 с компонентом 2 и свободным тирогормоном, а также специфическая иммобилизация компонента 2 или комплекса, образованного компонентом 2 и компонентом 3. На второй стадии происходят отмывка компонентов, не связавшихся с твердой фазой,и детектирование специфического сигнала, значение которого обратно пропорционально содержанию несвязанной фракции определяемого тирогормона в исследованном образце. Недостаток такой способ отличается громоздкостью, требует получения высокомолекулярных конъюгатов тирогормонов с , подготовки иммуноспецифического сорбента, а также эмпирического подбора четверки антител для твердой фазы, для конъюгата, меченых антител и иммуноглобулинов сыворотки крови, поскольку высока вероятность перекрестной реакции между ними, а также матрикс-эффекта, т.е. помех, привносимых в анализ различными компонентами биологического материала, присутствующими в анализируемых образцах 12. Задача настоящего изобретения - способ иммунохимического количественного определения тирогормона, выбранного из свободного 3 и свободного 4, в сыворотке крови человека, фармацевтических субстанциях и готовых лекарственных препаратах. Заявляемый способ не требует применения конъюгатов тирогормонов с высокомолекулярными белками, подготовки иммуноспецифичной твердой фазы и длительного эмпирического подбора высокомолекулярных компонентов. Поставленная задача решается заявляемым способом, включающим в себя одновременное смешивание твердой фазы, покрытой биотинсвязывающим белком (компонент 4),с анализируемым образцом или калибровочной пробой, содержащими свободные тирогормоны (компонент 5), и с мечеными антителами, проявляющими высокое избирательное сродство к выявляемому тирогормону (компонент 6), их инкубацию в течение 30-60 мин (инкубация 1) внесение в реакционную смесь низкомолекулярного конъюгата выявляяемого тирогормона с биотином (компонент 7) и инкубацию реакционной смеси в течение 10-15 мин (инкубация 2) разделение свободной и биоспецифически иммобилизованной 2 13850 1 2010.12.30 форм меченого антитела измерение интенсивности сигнала связанной формы меченых антител. Количественное определение содержания свободных 3 или 4 в анализируемых образцах осуществляется по калибровочному графику, построенному по значениям сигнала в калибровочных пробах с известными концентрациями свободных тирогормонов,имеющих матричный состав, аналогичный матриксу образца. В процессе инкубации 1 происходит связывание компонента 6 с компонентом 5. Затем,после добавления в реакционную смесь компонента 7, в процессе инкубации 2 происходит его связывание или связывание образующегося комплекса (компонент 7 / компонент 6) с компонентом 4 на твердой фазе. Активность метки в составе иммобилизованного компонента 6 обратно пропорциональна концентрации определяемого свободного тирогормона в пробах. В качестве твердой фазы могут служить коммерчески доступные формованные полимерные изделия (лунки микропланшетов, пробирки) производства- (Германия), (Дания) и др., наноструктурированные или наноразмерные магнитные или центрифугируемые частицы производства(США),(Германия) и др. В качестве биотинсвязывающего белка (компонент 4) могут быть использованы авидин(, кат.9275), стрептавидин (, кат.4762),( .,кат.31000),(, ., кат.7200-01), (, кат.2511), антитела против биотина и (или) остатка биотина в составе макромолекул (, кат.7653). Низкомолекулярные конъюгаты выявляемых тирогормонов с биотином (компонент 7) представляют собой соединения, содержащие один фрагмент 4 или 3, за который конъюгаты способны связываться с одним паратопом антител против 4 или 3, соответственно, и один остаток биотина, которым конъюгаты могут взаимодействовать с одним связывающим центром биотинсвязывающих белков. Примерами таких соединений могут служить-2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил 5-(2-оксо-гексагидро-1-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамид и -2-(2-ацетамидо-3-(4(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3-йодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1 тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамид. Способы получения приведены в примерах 1 и 2. В качестве метки для антител, проявляющих высокое избирательное сродство к выявляемым тирогормонам (компонент 6), может служить радиоактивный изотоп (например,125), фермент (например, пероксидаза из корней хрена) или соединение, способное к люминесценции (например, флуоресцеин). Соответствующие меченые антитела могут быть получены из антител к 3 (, кат.2777) и антител к 4 (, кат.2652) по типовым методикам с использованием коммерчески доступных наборов -( ., ., США кат.28600),(, кат.1),(, кат.1709). Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1 Получение -2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамида(конъюгат 4 с биотином) 1 г (1,12 ммоль) пентагидрата натриевой соли -тироксина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль) ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч при комнатной температуре, рН 8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 0,1 н. , затем водой, высушивают 24, упаривают в вакууме. Получают 0,86 г (1,05 ммоль, выход 94 ) -ацетилтироксина. Разлагается до достижения температуры плавления.0,28 (-, 21). 0,165 г (0,2 ммоль) -ацетилтироксина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят 0,032 г (0,28 ммоль) -оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 С и по каплям добавляют 3 13850 1 2010.12.30 0,045 мг (0,22 ммоль) ,-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,29 г (0,24 ммоль) трифторацетата -(3 аминопропил)биотинамида в 2 мл 0,13 и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой,водой, 0,1, водой и высушивают безводным 24. Получают 0,15 г (0,13 ммоль,выход 66 ) -2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3,5-дийодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления.0,43 (-, 21). 1 - ЯМР (500 МГц,6 - ДМСО), , м. д. 1,30 (м, 4, -2-), 1,48 (м, 6, -2-), 1,79 (с, 3, -3), 2,06 (т, 2, 7,2, 2-), 2,82 (дд, 1, 1 5,03, 2 12,46, ), 2,91 (дд, 1, 1 5,01, 2 13,31, ), 3,05 (м, 5, 22-2-2-), 4,13 (м, 1, (-)-), 4,31 (м, 1, 2), 4,42 (м, 1, -2-(-)-), 6,39 (с, 1, (-)-), 6,47 (с, 1, 2), 7,05 (с, 2,-22-), 7,77 (уш. т, 1,4,8, 2-), 7,79 (с, 2, -22-2-), 8,06(конъюгат 3 с биотином) 0,75 г (1,12 ммоль) натриевой соли 3,3,5-трийодтиронина растворяют в 300 мл этилового спирта и добавляют 220 мг (1,7 ммоль) ацетоксисукцинимида. Перемешивают 20 ч при комнатной температуре,8,5. Этанол упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 0,1 н. , затем водой, высушивают 24, упаривают в вакууме. Получают 0,7 г (1,01 ммоль, выход 92 ) -ацетилтрийодтиронина. Разлагается до достижения температуры плавления.0,23 (-, 21). 0,14 г (0,2 ммоль) -ацетилтрийодтиронина растворяют в 30 мл абс. диоксана и вносят 0,032 г (0,28 ммоль) -оксисукцинимида. Раствор охлаждают до 0 С и по каплям добавляют 0,045 мг (0,22 ммоль) ,-дициклогексилкарбодиимида в 2 мл диоксана. Перемешивают 1 ч при 0 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0,29 г (0,24 ммоль) трифторацетата -(3 аминопропил)биотинамида в 2 мл 0,13 и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь отфильтровывают, промывают последовательно водой, содой, водой, 0,1, водой и высушивают безводным 24. Получают 0,13 г (0,13 ммоль, выход 65 ) -2-(2-ацетамидо-3-(4-(4-окси-3,5-дийодофенокси)-3-йодофенил)пропанамидо)пропил-5-(2-оксо-гексагидро-1-тиено 3,4-имидазол-4-ил)пентанамида. Разлагается до достижения температуры плавления.0,35 (-, 21). 1- ЯМР (500 МГц, 6 - ДМСО), , м. д. 1,30 (м, 4, -2-), 1,48 (м, 6, -2-), 1,79 (с,3, -3), 2,06 (т, 2,7.2, 2-), 2,82 (дд, 1, 1 5,03, 2 12,46, ),2,91 (дд, 1, 1 5,01, 2 13,31, ), 3,05 (м, 5, 222-2-), 4,13 (м, 1, (-)-), 4,31 (м, 1, 2), 4,42 (м, 1,-2-(-)-С(О)-), 6,39 (с, 1, (-)-), 6,47 (с, 1, 2),), 6,74 (, 1,1,-22-2-), 8,06 (уш. т, 1,4,8, -(2)3), 8,20 (д, 1,8,39, 3). Пример 3 Проведение иммуноферментного анализа свободного 3 в сыворотке крови человека в лунках микропланшета В лунки полистирольного планшета с иммобилизованным биотинсвязывающим белком авидином ( , кат.6521-5) вносят по 50 мкл калибровочных проб (0,4 13850 1 2010.12.30 0,75, 1,5, 3, 6, 12 и 24 пМ), приготовленных внесением рассчитанных количеств натриевой соли 3,3,5-трийодтиронина (, кат.2752) в сыворотки крови, подвергнутые обработке углем 6, контрольных сывороток или исследуемых образцов сыворотки в дубликатах. Добавляют во все лунки по 25 мкл 4 нМ антител к 3, меченых пероксидазой из корней хрена, в фосфатном буфере. Планшеты инкубируют в течение 45 мин при комнатной температуре со встряхиванием, затем вносят во все лунки по 25 мкл 10 нМ конъюгата биотин-3 и продолжают встряхивание в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем удаляют жидкость из лунок и промывают их трижды фосфатным буфером, содержащим 0,9 и 0,02-20. Во все промытые лунки добавляют по 100 мкл хромоген-субстратной смеси (раствор 3,3,5,5-тетраметилбензидина в буфере с перекисью водорода) и инкубируют при комнатной температуре без встряхивания в течение 10 минут. Останавливают реакцию добавлением во все лунки по 100 мкл раствора стопреагента (4,8 раствор 24). Измеряют в многоканальном планшетном спектрофотометре оптическую плотность растворов во всех лунках при длине волны 450 нм. В прямых координатах строят график зависимости оптического сигнала от концентрации свободного 3 в калибровочных пробах (пмоль/л). Типичная для этой системы калибровочная кривая имеет линейную зависимость и максимальное значение сигнала в диапазоне 1,6 - 2,2 о.е., который падает на 80 в последней точке калибровочного диапазона. Значения концентраций свободного 3, определенные в контрольных сыворотках,попадают в предписанные интервалы (табл. 1). Таблица 1 Определение 3 в контрольных сыворотках различных диапазонов концентраций Пример 4 Проведение иммунорадиометрического анализа свободного 3 в сыворотке крови человека в пробирках В полистирольные пробирки с иммобилизованным стрептавидином (, кат.127501-8) вносят по 0,05 мл калибровочных проб (0, 0,75, 1,5, 3, 6, 12 и 24 пМ),приготовленных внесением рассчитанных количеств натриевой соли 3,3,5-трийод-тиронина (, кат.2752) в сыворотки крови, подвергнутые обработке углем 6,контрольных сывороток или исследуемых образцов сыворотки в дубликатах. Добавляют во все пробирки, включая пробирки для измерения общей активности метки , по 0,4 мл раствора 125 анти-3. Пробирки инкубируют в течение 60 мин при комнатной температуре со встряхиванием, затем вносят во все лунки по 0,05 мл конъюгата биотин-3 и продолжают встряхивание в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем удаляют жидкость из всех пробирок, кроме , и измеряют в них скорость счета в течение 1 мин в сцинтилляционном счетчике колодезного типа. Рассчитывают величину /0100 для каждой калибровочной, контрольной и исследуемой пробы, где 0 - среднее значение скорости счета в пробирках, содержавших калибровочную пробу 0 пмоль/л,- средние значения скорости счета в других пробирках, содержавших анализируемые образцы. Рассчитанное значение 0/ используют как одну из оценок качества анализа. В координатах - строят график зависимости /0100 от концентрации свободного 3 в калибровочных пробах (пмоль/л). По калибровочному графику определяют содержание 3 в контрольных сыворотках и исследуемых образцах. Значения кон 5 13850 1 2010.12.30 центраций свободного 3, определенные в контрольных сыворотках, попадают в предписанные интервалы (табл. 2). Таблица 2 Определение 3 в контрольных сыворотках различных диапазонов концентраций Предписанные значения Открытые значения свободн. 3, пм свободн. 3, пм Контрольная сыворотка 1 2,8-4,0 3,1 Контрольная сыворотка 2 8,9- 12,7 9,7 Контрольная сыворотка 3 13,9-24,2 22 Пример 5 Определение количественного содержания 4 в фармсубстанциях и лекарственных препаратах методом иммуноферментного анализа с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином В лунки микропланшета с низкой связывающей способностью (, кат.3474) вносят по 25 мкл суспензии магнитных частиц с иммобилизованным биотинсвязывающим белком стрептавидином (1, кат.650.01, , США), по 50 мкл калибровочных проб (0, 0,37, 0,75, 1,5, 3, 6 и 12 мкМ), приготовленных на основе последовательных разведений контрольного 4 (,кат.2501) в 0,01, или исследуемых образцов 4, полученных путем экстракции 0,01 из таблеток или фармсубстанций и разведенных тем же раствором в 1000 раз, в дубликатах и по 25 мкл раствора анти-4, меченых пероксидазой из корней хрена. Планшеты инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре со встряхиванием, затем вносят в каждую лунку по 25 мкл конъюгата биотин-4 и инкубируют, продолжают инкубацию в течение 10 мин. Затем магнитные частицы промывают трижды,переносят в лунки с хемилюминесцентно-субстратной смесью (раствор люминола в буфере с перекисью водорода) и инкубируют при комнатной температуре без встряхивания в течение 5 мин в темноте. Измеряют в многоканальном планшетном спектрофлуориметре относительный выход флуоресценции в каждой лунке. Строят график зависимости оптического сигнала от концентрации 4 в калибровочных пробах. Типичная для этой системы калибровочная кривая имеет линейную зависимость и падение относительного сигнала флуоресценции на 95 в последней точке калибровочного диапазона. По калибровочному графику определяют содержание свободного 4 в исследуемых образцах, учитывая коэффициент разведения. Значения концентраций свободного 4, определенные в контрольных образцах препаратов, попадают в предписанные интервалы (табл. 3). Таблица 3 Определение 4 в лекарственных препаратах различных производителей Предписанные значения Открытые значения содержания 4, мг/табл. содержания 4, мг/табл.- 100 -,-/(Герма 100 98 ния) Левотироксин натрия таблетки,0,0001 г в блистере (РУП Белмед 100 98 препараты) ЭУТИРОКС 100,100 101(Германия) Приведенные примеры показывают, что заявляемый способ позволяет определять свободные тирогормоны в сыворотке крови человека в диапазоне 0 - 25 пМ, в фармсубстанциях и лекарственных тирогормонсодержащих препаратах - в диапазоне 0 - 12 мкМ. 6 13850 1 2010.12.30 Источники информации 1.4410633.3,5,3-заявл. 22.09.80 опубл. 18.10.83. 2.0089806.приоритет 22.03.82 опубл. 28.09.83. 3.4292296.заявл. 12.09.78 опубл. 29.09.81. 4.4046870.заявл. 30.06.76 опубл. 06.09.77. 5.3646346. -заявл. 26.12.68 опубл. 29.12.72. 6. , (4)4/ , . //. - 2007. - . 53. . 911-915. 7.0303284.приоритет 14.08.87 опубл. 15.02.89. 8.6331441.заявл. 21.12.98 опубл. 18.12.01. 9.0246152.3 / 4 приоритет 12.05.86 опубл. 19.11.87. 10.9322675.приоритет 06.05.92 опубл. 11.09.93 (прототип). 11.8906363.приоритет 08.01.88 опубл. 13.07.89. 12. Урусова М.Е. Сравнительный анализ определения концентрации ряда аналитов в сыворотке крови с использованием коммерчески доступных наборов реагентов четырех фирм-производителей (Алкор Био, ,и) / Урусова, М.Е. и др.// Коммерческая биотехнология Электронный ресурс. - 2008. - Режим доступа Национальный центр интеллектуальной собственности. 20034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7