Способ получения полной кодирующей последовательности кДНК тирозинкиназы семейства Csk из лимфоцитов человека

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛНОЙ КОДИРУЮЩЕЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ кДНК ТИРОЗИНКИНАЗЫ СЕМЕЙСТВАИЗ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Баранова Людмила Александровна Емельянова Валентина Павловна Волотовский Игорь Дмитриевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения полной кодирующей последовательности кДНК тирозинкиназы семействаиз лимфоцитов человека, отличающийся тем, что выделяют из лимфоцитов тотальную РНК, путем обратной транскрипции синтезируют первую цепь ДНК, причем используют праймеры 53 и 530-3, и затем проводят амплификацию полноразмерной 11474 1 2008.12.30 кДНК с помощью гнездовой полимеразной цепной реакции с праймерами на нетранслируемую область гена, локализованную в его структуре на расстоянии 197 п.н. откодона и 171 п.н. после стоп-кодона, причем в качестве наружных праймеров используют 5-3 и 53, а в качестве внутренних - 53 и 53. Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано при клонировании и характеристике большого количества эукариотических генов. Известен способ получения полноразмерной кДНК гена белка гипоксантинфосфорибозилтрансферазы путем создания и скрининга кДНК библиотеки, содержащей клоны со вставками различного размера 1. В этом способе двухцепочную кДНК встраивали в плазмиду р 6 В 2 аЕ 2. Плазмидной ДНК трансформировали культуру Е. . После чего проводили селекцию и определяли соответствие размеров вставок клонов клонируемой последовательности. Наиболее близким по своей сущности к предлагаемому изобретению является способ определения полной кодирующей последовательности гена белка и выявления новых членов семейства мембраносвязанных тирозинкиназ 2. В данном известном способе использовали метод амплификации с помощьюПЦР (полимеразной цепной реакции) на матрице мРНК тканей языка человека с применением специфических к тирозинкиназе праймеров,праймеров, а также конструирование и скрининг кДНК библиотеки. Для анализа ПЦР-продукты лигировали в вектори секвенировали. Однако получить полноразмерную копию кДНК не всегда удается. При использовании библиотеки кДНК селективность клонирования гена, кодирующего необходимый белок, является невысокой. В то же время методики составления библиотеки кДНК являются довольно сложными и не достаточно универсальными. Задачей данного изобретения является получение более полной информации о геномной последовательности полной кодирующей последовательности кДНК гена тирозинкиназы из лимфоцитов крови человека. Это позволяет идентифицировать структуру экзонов гена и определить его кодирующий потенциал, что дает крайне ценную информацию для анализа структуры и функции гена и его использования в медицине и технике. Генэукариотического нерецепторного белка тирозинкиназы представляет особый интерес с точки зрения понимания механизмов возникновения некоторых генетических заболеваний. Поставленная задача решается следующим образом. В способе получения полной кодирующей последовательности кДНК тирозинкиназы семействаиз лимфоцитов человека выделяют тотальную РНК из лимфоцитов, путем обратной транскрипции синтезируют первую цепь ДНК с использованием праймеров 53 и 5303. После чего проводят амплификацию полноразмерной кДНК, используя гнездовую полимеразную цепную реакцию с праймерами на нетранслируемую область гена, локализованную в его структуре на расстоянии 197 п. н. от АТ кодона и 171 п. н. после стопкодона. В качестве наружных праймеров используют 53 и 53, а в качестве внутренних - 53 и 53. Использование гнездовой полимеразной реакции и двух пар праймеров 1 -1 и 2 -2 позволило получить фрагмент кДНК гена , включающий полную кодирующую область и участки нетранслируемых областей, и получить способ эффективного клонирования полной кодирующей последовательности кДНК тиразинкиназы семействаиз лимфоцитов крови человека. 2 11474 1 2008.12.30 Пример конкретного осуществления заявленного способа. Способ получения полной кодирующей последовательности кДНК тирозинкиназы семействаиз лимфоцитов человека включает следующие стадии. Получение лимфоцитов периферической крови. К 10 мл крови добавляли равный объем трис-солевого буфера(0,14 М ,5 мМ КС, 25 мМ трис-, рН 7,4). Смесь наслаивали при комнатной температуре на равный объем среды для выделения лимфоцитов (1,077), содержащей 9 и 34 растворы фиколла и урографина соответственно. После 20 мин центрифугирования при 1500 об./мин слой лимфоцитов (кольцо на разделе двух фаз) отбирали и разводили в большом объеме буфера . После повторного 10 мин центрифугирования при тех же условиях проводили лизис остаточных эритроцитов, которые тщательно суспендировали в 1 мл холодной воды , затем добавляли 1 мл 0,3 Ми -буфер. После 10 мин центрифугирования при 1500 об./мин клетки суспендировали в -буфере и подсчитывали их количество в камере Горяева. Выделение тотальной РНК. Клетки, полученные на предыдущей стадии, лизировали в необходимом объеме буфера Д (4 М гуанидинизотиоционат, 25 мМ цитрат натрия, рН 8,0 0,5 саркозинат натрия 0,1 М 2-меркаптоэтанол) из расчета 1 мл буфера Д на 107 клеток. Смешивали лизат, 2 М ацетат натрия, рН 4,0, фенол (насыщенный водой) и хлороформ в соотношении 10,110,2 (по объему). Смесь инкубировали на льду 15 мин и центрифугировали 10 00020 мин при 4 С. Затем водную фазу переносили в другую пробирку и добавляли к ней 1 объем изопропанола, хорошо перемешивали и инкубировали при 20 С 1 ч. Осаждали РНК центрифугированием при 10 00020 мин при 4 С. Осадок растворяли в 0,5 мл буфера Д и проводили с ним вышеописанную процедуру еще раз. После этого осадок промывали 75 этанолом, осаждали, подсушивали, растворяли в 50 мкл воды и использовали для синтеза кДНК. Синтез первой цепи кДНК. Реакционная смесь для отжига олигонуклеотидов (5 мкл) содержала 0,3 мкг суммарной РНК, 10 пмольолигонуклеотида (53), 10 пмольпраймера (530-3). Смесь прогревали при 72 С в течение 2 мин, затем охлаждали на льду(2 мин). Синтез первой цепи осуществляли в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл РНК с олигонуклеотидами, 200 единиц обратной транскриптазы,1 буфера для синтеза 1 цепи (50 мМ Трис- (рН 8,3) 75 мМ КС 6 мМ 2), 2 мМ дитиотрейтол, 1 мМ(содержащий , , , ). Обратную транскрипцию проводили при 42 С в течение 1,5 ч. Реакцию останавливали прогреванием при 70 С в течение 10 мин. Амплификация гена . Для получения полноразмерной кДНК были подобраны специфические праймеры, на основе последовательностей генов тирозинкиназычеловека ( ), полученные из банков данных , ,и . Праймеры были разработаны на основании известной нуклеотидной последовательности гена(. 004383) на нетранслируемую область и были локализованы в структуре гена на расстоянии 197 п.о. от АТ кодона и 171 п.о. после стопкодона. Подобранные праймеры (олигонуклеотиды) приведены в табл. 1. Таблица 1 праймер 1 53 праймер 2 53 праймер 1 53 праймер 2 53 3 11474 1 2008.12.30 Для амплификации полноразмерной кДНК генаиспользовали смесь полимерази способ гнездовой ПЦР. Наружные (ПЦР-1) и внутренние (ПЦР-2) праймеры были подобраны на основании нуклеотидной информации о гене . Первую цепь кДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР-1. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 15 нг первой цепи кДНК 1 буфер 200 мкМ 0,2 мкМ 1 праймера 0,2 мкМ 1 праймера 1. Было проведено 32 цикла ПЦР для амплификации кДНК гена(-200) в следующем режиме одного цикла 95 С - 7 с 65 С - 20 с 72 С - 1 мин. К 1 мкл продукта ПЦР-1 добавляли 39 мкл водыи 1 мкл разбавленного продукта ПЦР-1 использовали для ПЦР-2. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл разбавленного продукта ПЦР-1 1 буфер 200 мкМ 0,2 мкМ 2 праймера 0,2 мкМ 2 праймера 1. Было проведено 15 циклов ПЦР (-200). Температурный режим каждого цикла включал 95 С - 7 с 65 С - 20 с 72 С - 1 мин. Клонирование продуктов ПЦР-2. Полученный образец (ПЦР-2) клонировали в векторе 16 и после чего использовали для трансформации Е. . Определение первичной нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов. Для фрагментов длиной 1721 п.о. и 1300 п.о. было отобрано по 3 клона с последующим выделением плазмидной ДНК. Вставки плазмид, содержащие фрагменты длиной 1721 п.о. и 1300 п.о., секвенировали с использованием праймеров -3,4,3, 13 , 13(табл. 2). Таблица 2 праймер 3 53 праймер 4 53 праймер 3 5 - -3 1353 1353 При помощи гнездовой ПЦР и двух пар праймеров ( 1 и 1,2 и 2) получен фрагмент кДНК гена , включающий полную кодирующую область и участки нетранслируемых областей. В результате амплификации указанным выше методом получен фрагмент предполагаемой длины 1721 п.о., что соответствует расчетным данным. Однако одновременно с ним амплифицируется фрагмент, содержащий 1300 п.о., фиг. 1,который, как следует из данных ПЦР, также является специфическим. Амплификация данного фрагмента связана, вероятно, с наличием альтернативно-сплайсированной формы мРНК. Альтернативный сплайсинг С-конца описан достаточно давно, и надо отметить,что все сплайсированные формы кодируют идентичный белок 3. Показано, например,что альтернативно сплайсированная форма мРН р 53 у человека кодирует белок сильно укороченным С-концом (341 аминокислота вместо 393). Аналогичная ситуация наблюдалась и в описанном случае. Амплифицированные фрагменты длиной 1721 п.о. и 1300 п.о. клонировали в векторе рА 16, затем кДНК клоны были выделены и охарактеризованы. Скрининг колоний проводили с помощью ПЦР с праймерами М 13 и М 13 . После проведения скрининга отбирали колонии, содержащие вставки длиной 1700 п.о. и 1300 п.о. Вставки плазмид, содержащие данные фрагменты, были секвенированы с использованием праймеров - М 13 , 13 ,3,4,3. 4 11474 1 2008.12.30 В результате сиквенса оказалось, что фрагмент большей длины содержит 1624 п.о., и в 5-нетранслируемой области (5-) он короче рассчитанного теоретически на 97 п.о. Амплифицированный участок полноразмерной кДНК генасодержит открытую рамку считыванияиз 1353 п.о., 5- из 114 п.о., расположенный перед первым кодоном , а также 3- из 171 п.о., расположенный после стоп-кодона, фиг. 2. По литературным данным кодирующий регион в геномной ДНК включает в себя 4,9 т.п.н. Он включает в себя 12 экзонов размером от 66 и 220 п.о. Длина интронов, располагающихся между экзонами, варьирует от 76 до 920 п.о. При помощи программыустановлено, чтокодирует предполагаемый белок из 450 аминокислотных остатков, обладающий молекулярной массой 50 573 Да и который с 99 гомологией можно отнести к -тирозинкиназе, фиг. 3. Молекулярные массы охарактеризованных на данный момент восьми классов нерецепторных тирозинкиназ варьируют от 50 до 150 кДа 4. Полученный нуклеотидной последовательности белок обладает типичной для киназы структурой. В его состав входят 2 домен (81-170 аминокислотных остатка) 3 домен (14-67 аминокислотных остатка) каталитический домен (188-443 аминокислотных остатка), включающий в себя последовательность, типичную для активного центра тирозинкиназ два сайта фосфорилирования (184, 304). Таким образом, анализ структуры гена и кодируемого им белка дает основания утверждать, что получена кДНК гена -тирозинкиназы, включающая полную кодирующую область и участки нетранслируемых областей. Полученная кДНК может быть использована для анализа структуры гена -тирозинкиназы в нормальных и патологически измененных клетках крови человека в целях выяснения механизмов возникновения различных патологий. Методика клонирования гена -тирозинкиназы упрощена и улучшена. Благодаря исключению трудоемкой процедуры создания кДНК библиотеки данное изобретение значительно упрощает способ получения полной кодирующей последовательности кДНК тирозинкиназы семействаи повышает селективность клонирования гена. Источники информации 1.. . . . . , 1983. - . 80. - . 477-481. 2... . . . . , 1991. -.88. - . 10411-10415. 3.. . 8, 1993. - . 2025-2031. 4... ,1995. - . 268, 251-255. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7