Способ получения плазмиды, кодирующей активатор плазминогена

далее в сшттетичеасуто последовательность всграи- этою встраивают структурный ген активатора вают два следующих дРУг за другом термина- плазминогена со следующей последоватора транскрипции тгр А-терминатор и/ или тел ьностью нуклеотидовъет А/отГА терминатор из Тп 10, послеБ 1 п Б 1 п Рпп на туг туп 51 5 51 ч 1 тм ть д м д САБ БАБ СС 6 ВАС ТАС ТАС ЕЕ ТЕ Ед ЕТ АСЕ АСЕ А АЕ С Е 1 гвс ас вд с сдп та д АСЕ вд т т сд Ч 3 Е 1у Ргп Ьец Ча 1 Ъ Бег Ьви Б 1 п В 1 Ас ив Тпг ьец Тпг Б 112 373ссд си втт тст стс см св св АТБ дсс сто АСС ее дтт начв 1 Бег Тгр Б 1 у Аг е 1 у Су А 1 в Ьвц Ьуа Аза ь Р 51 ч 1БТТ ТСТ ТЕБ ЕЕТ СВ ЕБТ ТЕС ЕСТ СТЕ ААА БАС Ах СЕ ББ ЕТ 12 1 Тпг Аг Ча 1 Бег Н 1 в Рпе Ьец Ргп Тгр 11 е Аг Бег на тп ь 51 405 АСС св втт тст см т ств все тес Атссв шт сдм АЙ. эд 42513 Б 1 ц Азп Б 1 Ьви Ада Ьец 411БАА ААС ЕЕ СТБ ЕСТ ЕТЕ ТААЕЕТАОСССЕССТААТБАБСЕБЕЕТТТТТТТТАТСЕАТ 1315встраивают ггр промотор со следующей последовательностью нуклеотидовили вас промотор из плазмиды р гас ЗВТЦБМ 5018).2. Способ по п.1, отттичатшпийся тем, что из плазмиды рВК 322 предварительно удаляют Мое Ш-Рш Ц фрагмент ДЪШ, шдержаппт птс/Ьош область.3. Способ по пп.1-2 отличающийся тем, что из плазмиды рВЕ 322, предварительно удаляют ЕсоКУ-Ыгп 1 фрагмент ДНК, содержащий часть гена, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину.4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что структурный ген встраивают последовательно. 5. Способ по гпт.1-3, отличающийся тем, что для ушил-пешая расстояния между последоватетгьностъю Шайн-Далгарно и стартовым кодоном проводят гидролиз плазмиды рестриктазой Мое 1 достраивают место разреза с помощью фрагмента Кленова ДНК - полимеразы 1 и лигируют место разреза ДНК-липазой.Изобретение предназначено для использования при терапии, обусловленной фибрином закупорки сосудов, как, например, инфаркта сердца, эмболии легких, артериальных сосудистых заболеваний конечностей и др., где активаторы плазминогена играют существенную роль, т.к. обуславливают растворение тромбов.Известно, что активатор плазшшотена был назван урокииазой, в действительности имеющей разтптчньте формы. Все эти формы получают,однако, непосредственно из одной молекутпяпредшественника - шшогена проурокиназы. Было установлено, что эта проурокштаза обладает одноцешчой структурой и она была названа асиРА (вши спаш штпагу р 1 азпипореп акйуатог). Этот зсц-РА состоит из 411 аминокислот и гликолизирован в природной предшесгвувщей форме до аминокислоты 302.Из различных работ известно генотехиолоптческое получение вегтшкозшшрованной части протеина зсп-РА, которое названо как гвсп-РА(рекомбинированный зсп-РА). При терапевтическом использовании гзсц-РА оказалось,что его наблюдаемое действие и совместимость превосходят употреблвемые фибринолитики.Известен способ получения плазмиды, кодирующей активатор плазминогена, путем гидролиза с помощью рестриктаз векторной молекулы ДНК, встраивания в нее фрагментов ДНК, несущих структурпъпй ген активатора плазминогеиа и регуляторные области 1.Известные до настоящею времени этот и другие способы получения штазмиды основаны наэкспрессии структурного гена зси-РА, выделенного из человеческих тканей. К сожаленит-о, при этом достигается лишь незначительная степень экспрессии, которая не обеспечивает экономичное получение целевого продукта в больших количествах.При проверке данных в различных штаммах было получено менее 2 протеина бактерий гзсп-РА.Неожиданно было обнаружено, что бактерии, трансформированные плазмидами, полученными в соответствии с изобретением,дают во много раз большую степень экспрессии, чем штамм-хозяин, идентично трансформированный плазмидами, известными из уровня техники. Полученные в соответствии с изобретением плазмиды более пригодны, чем все известные до настоящего времени плазмидьт, для получения гвсц-РА или его протеина предшествующей стадии.Способ получения плазмилы, кодируюшей активатор плазмниотена, согласно изобретеншо заключается в том, что проводят гидролиз векторной плазмиды рВК 322 с помощью ЕсоК 1 и Нйпа Ш рестриктаз, осуществляют последовательное встраивание синтетического нуклеотида, содержащего последовательность Шайн-Далгарно, стартовый кодон и имеющего последовательность нуклеотидов (фигд), далее в синтетическую последовательность встраивают два следующих друг за другом терминатора транскрипции тгр А-терминатор и/или тет А/огТА терминатор из Тп 10, после этого встраивают структурный ген активатора плаз 7 ВТ 1244 С 1 вмнногена со следующей последовательностью нуклеотидов (фиг.15) встраивают промотор со следующей нуклеотидной последовательностью (фиг.8) или Тас промотор из плазмиды ргас БВТШБМ 5018).Далее из плазмиды рВЕ 322 предварительно удаляют Мое Е-Рш П фрагмент ДНК, содержащий пйс/Ьош область.Из плазмиды рВК 322 предварительно удаляют Есо К-Ыш 1 фрагмент ДНК, содержащий часть гена, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину.Структурньш ген встраивают последовательно.Для удлинения расстояния между последователъностью Шайн-Далтарно и стартовым кодоном проводят гидролиз плазмиды рестриктазой Мое 1, достраивают место разреза- с помощью фрагмента Кленова ДНК-полиме разы 1 и лигируют место разреза ДНК-лигазой.Используемые в предложенной заявке сокращения имеют следующие значенияПри конструировании использованного в новых плазмидах структурного гена предпочтительно встраивают закодированные для соответствующих аминокислот приведенные в следующей таблице базовые последовательности. При этом в структурном гене не должны быть выполнены одновременно все эти отличительные признаки.Аминокислота Триплет аргинин СОТ лейцин СТО валин СтТТ пролин СССт глицин СтбТС другой стороны, при построении структурного гена целесообразно, по возможности, избежать применения следующего кодона для соответствующих названных аминокислот(причем снова не должны выполняться одновременно эти отличительные признаки для всех аминокислот).Кодов, которого Аминокислота следует избегать АТА изолейцинСТС валин ССО пролин ААСт лизин АСтСч, АСА, ССС, СОА аргинин ОСА, 066 глицинПутем выбора кодона в соответствии с изобретением для отдельных аминокислот в структурном гене, а также вышеназванных отличительных признаков контрольного гена,полностью препятствуют образованию стабильных вторичных структур между структурным геном и контрольным регионом.Для получения синтетического структурного гена сначала синтезируют олитонутслеоггиды в отрезке 40-80 оснований в одну цепочку. Целесообразно получать их в масштабе 1 мкм мол по методу твердых фаз. В качестве мономерноп) синтона применяется при этом имеющийся в продаже Б-циано-эггил-замещешше дтшзопропнлашшо-фосфорашгдиты соотвегствуюпшх необходимых дезоксирибонуклеозидов. После отщепления от носителя находящиеся на концах еще тритилзамещенные нити обессоливаются в стерильных условиях путем гельфштьтрации и предварительно очищаются и затем в две стадии подвергаются первому разделению с помощью возвратной фазы - НРЪБ. Соответствующий основной продукт детритшшрутот и посте двух дополъштеттьътых стадий очистки возвратной фазы - НРШ получают целевой олигонуклеотъщ высокой чистоты, как показал гельэлектрофорезный анализ (РАОЕ).Из группы 4-9 этих отдельных нитей получали затем длиной около 200 нуклеотидов фрагменты двойных цепей, чтобы неконцевые отдельные олигонуклеотиды у 5 -конца фосфорилировать и соответствующие комплементарные нити вместе с концевыми олигонуклеотидами ренатурировать и лигировать. После Литании образовавшиеся способные к клонированию двойные цепные фрагменты используют затем в подходящих линеаризированных векторах. Дополнительные меры можно узнать из нижеприведенных примеров.Для конструирования в соответствии с изобретением новых плазмидов предпочтительно исходят от имеющейся в продаже плазмиды рВЕ (4363 бп). Предпочтительно из нее элиминируют пйс/Ьош область и/или тетрациклиновый резисцентный ген. При этом нет необходимости полностью удалять ген резистентности к тетрациклину, чаще всего достаточно, чтобы плазмида не передала трансформированному, таким образом, штамму бактерии устойчивости к тетрациклину. С помощью этих мер (удаление пЕс/Ьош области и к тому же части гена резистентности к тетрациклину) получают так называемую высоконадежную плавмиду.Предпочтительной стратегией для конструировании новой плазмиды в соответствии с изобретением, исходя из модифицированной, как упоминалось выше, плазмиды рВК 322 является в качестве последующей стадии встраивание синтетического сайта мулътиклоъшрования между местом разреза Есо К 1 и ниш Ш. Этот сайт мультиклонирования (фиг.2) имеет установленную последовательность мест разреза,лежащие между ними основания являются ПРОНЗВОЛЬНО ВЫБРЗННЫМИ, за ИСКЛЮЧЕНИЕМ ПОследовательности между ХЬа 1 и ЫбеЬ которые содержат места связи рибосом (Шайн-Далгаркто-последовательность) на Ху 1-оперона 5 АА 6 СЭА 6-З(4) Ввиыйпз, а также установленного расстояния межцу ш.Д.-ПОСЛЕДОВВТЫ 1 ЬНОстыо и стартовым кодоном АТС. Следующие за Ш.Д.-последовательностью основания САААТ перенесены из (4) и Связаны С САТАТСЗ, местом разреза Нос 1. Таким образом расстояние между Ш.Д.-ПОСЛЕДОВЗТВЛЬНОстью и АТБ составляет 8 основных пар. Расстояния между отдельными местами разреза сайта мультиклонирования должны быть из соображений технологии клонирования, по меньшей мере, около 20 нуклеотидов, в результате чего облегчается удаление промежуточных фрагментов.С помощью этого сайта мультиклонирования в плазмиду вводят места разреза, которые целесообразно после встраивания терминатора транскрипции-делают возможным следующее друг за другом успешное встраивание частичной последовательности зсп-рА структурного гена, предпочтительно начинающегося от СКОНЦЕ ЦСЛСВОГО ПРОТВИНН, Т.С. ОТ ЗдКОНЦЗ НИТИ ДНК получающегося структурного гена, а также ВСТРНИВВНПЯ, например, СИНТЕТИЧЕСКОГО или также выделенного из другой плазмиды или имеющегося в продаже тгр-промотора. ПОЛНЭЯ НУКЛЕОТИДНЗЯ ПОСЛСДОВЗТСЛЬНОСТЬ ПОлученного таким образом зси-РА-сгруктурнош гена ПРВДСТЗВЛСНИ С УКЗЗВНИВМ ЗМИНОКИСЛОТ,соответствующих отдельному кодону, на фиг.15.Другие новые плазмиды могут быть получены в соответствии с изобретением из сконструированной, как описано выше, плазмиды,например, путем разреза с помощью Есо В 1 Ншс 111 получают синтетический зси-рАструктурный ген со всеми единицами регулирования и затем встраивают в другой, в знтеробактерийнуто, в частности, Е.со 11, автономно шложащзпося плазмиду, который к тому же линеаризируют или укорачивают с помощью разреза с помощью Есо В 1 и шла 111. Таким же в принципе способом, но при использован места разреза Есо Е 1 и ХЬа 1 можно заменить также, например, гр-промотор ас-промотором (и наоборот) в по 10Аналогично можно исходить также из других известных плазмид, которые обладают единственным местом разреза Есо Е 1 и Нйпс Ш,например фиг.9, фиг.12, фиг.1 З фиг.18, фиг.19 И ДРУГИЕ.Новые плазмиды с увеличенным расстоянием между Шайн-Далгарно-последовательности и стартовым кодоном АТС можно получить в соответствии с изобретением тем, что сконструированная как описано выше плазмида, в которой упомянутое расстояние составляет например, 8 нуклеотидов, разрезают Мае 1, которое заполняет полученное место разреза и непосредственно после этого полученные концы лигируют, в результате чего образуется желаемая новая нлазмида, в которой расстояние мейжду Ш.Д.-последовательностью и стартовнм кодоном составляет, например, 10 нуклеотидов.Как уже было сказано, с бактериями, трансформированными плазмидами, полученными в соответствии с изобретением, может быть достигнута во много раз большая степень экспрессии, чем в случае известных из уровня техники плазмидов. Трансформацию подходящих компетентных организмов-хозяев осуществляют известным образом. Для экспрессии полученных в соответствии с изобретением плазмидов особенно пригодны организмы-хозяева штамма типа Е.со 1 й и применяемые энтеробактерии как, например, штаммы Езеиоошопаз, БаПШопеНа, Ептегоъастег,КеЬзйе 11 а или Беггойа.Предпочтительными организмами-хозяевами являются штаммы типа Е.со 11 как, например,Е.со 1 й СЕТ-Е и в частности штаммы Есон подгруппы К 12 как, например, Е.со 11 К 221 М 101/АТСС ЗЗ 876/, Е.со 11 К 121 М 103/АТСС З 9403/, Е.со 1 й К 12 ДМ 1 О 5/1 ЭБМ 4162/, Е.со 1 К 12 АТСС 31446 или также Е.со 11. К 1213 Н 1/АТСС 33849/.Введение экспрессии в экспрессионную систему е.со 11, которая содержит тас-промотор, можно осуществлять, например, путем добавления лактозы изш отбора глюкозы, но предпочтительно путем добавления изопропил- Б-Вчгиогалактопиранозида. Однако если в плазшще имеется тгр-промотор, то иншгкцито осуществляют предпочтительно с помощью индолакрилуксусной идш иидолакршшропионовой шслоты. Другие извеспше ш-щукторы, само собой разумеется,могут быть также использованы.После индукции и достижения определенной вышеуказанной плотности клетки, клетки отделяют центрифугированием, и остаток после центрифугирования после суспендирования в водном соленом растворе переводят, например,в гомогенизатор, в котором клетки в резуль