Способ индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучения лимфоцитов человека

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ИНДИКАЦИИ НАСЛЕДСТВЕННОГО КЛЕТОЧНОЛЕТАЛЬНОГО ЭФФЕКТА НЕКОНТРОЛИРУЕМОГО ХРОНИЧЕСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Институт генетики и цитологии НАН Беларуси(73) Патентообладатель Институт генетики и цитологии НАН Беларуси(57) Способ индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучениялимфоцитов периферической крови человека, включающий забор крови, культивирование лимфоцитов в питательной среде, содержащей фитогемагглютинин, добавление блокатора деления цитоплазмы - цитохолазина В, витальное окрашивание и микроскопирование, отличающийся тем, что определяют частоту репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облученныхлимфоцитов и при наличии статистически достоверной разницы между контрольными и опытными показателями судят о наследственном клеточно-летальном эффекте неконтролируемого хронического облучения лимфоцитов. Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучениялимфоцитов периферической крови человека. Аналогом данного способа исследования является способ, предназначенный для учета интерфазной гибели клеток тимуса, селезенки и кишечника мышей при действии низких доз радиации 1, основанный на том,что 0,02 раствор эритрозина Б инкорпорируется в мертвые клетки и окрашивает их в красный цвет. Учет эритрозин Б положительных клеток производится путем подсчета их с помощью микроскопа. В работах других авторов 2, 3 при использовании способа дифференциального окрашиваниябыла исследованарадиочувствительность лимфоцитов от больных хроническим лимфоцитарным лейкозом. Выделенные лимфоциты периферической крови этих больных облучали, инкубировали в течение 4 суток, а затем способом дифференциальной окраски живых и мертвых клеток определяли гибель клеток. 3042 1 Результаты характеризовались воспроизводимостью как при повторных исследованиях одного образца, так и при исследовании различных образцов от одного больного. Прототипом данного изобретения может быть способ, предложенный . для проведения цитогенетического мониторинга популяций человека 4. Указанный способ состоит в том, что использовали кровь здоровых доноров, полученную стерильно методом венопункции. После выделения лимфоцитов в градиенте фикол-верографина их витально окрашивали трипановым синим и автоматически подсчитывали количество жизнеспособных лимфоцитов, после чего их использовали для культивирования. Индивидуальная культура, содержащая 1 млн. лимфоцитов на 1 мл питательной среды, включающей 15 объема инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, ФГА фирмыв концентрации 5 мг/мл, инкубировалась при температуре 37 С в течение 44 часов в атмосфере 10 двуокиси углерода. Затем в культуру вводили цитохалазин Б в концентрации 4,5 мг/мл культуральной смеси. Фиксацию культуры производили на 72 часу от начала культивирования абсолютным метанолом в течение 10 минут. Готовили по 2 препарата на культуру и окрашивали по Май-Грюнвальд Гимзой для оценки интерфазно погибших лимфоцитов. Однако данный способ не может быть использован в таком виде, так как он имеет ряд существенных недостатков. 1. Для проведения анализа с помощью описанного способа требуется, как минимум, 10 мл венозной крови. Столь большие объемы крови для данного анализа можно получить только с помощью достаточно болезненного для детей метода венопункции. 2. С помощью указанного способа может быть проведена только оценка интерфазной гибели лимфоцитов, т.е. жизнеспособности выделенных лимфоцитов до их культивирования. 3. Используемый способ не дает ответа на вопрос о том, как действует радиационный фактор на пролиферативные возможности клеток крови человека. Задача, на решение которой направлено изобретение, состоит в том, что для проведения лечебных и профилактических мероприятий по раннему выявлению признаков хронического радиационного воздействия введено исследование частоты а) репродуктивно погибших и б) выживших потомков хронически облученныхлимфоцитов. Поставленная цель достигается тем, что в способе индикации наследственного клеточно-летального эффекта неконтролируемого хронического облучениялимфоцитов человека, включающем забор крови,культивирование лимфоцитов в питательной среде, содержащей фитогемагглютинин, добавление блокатора деления цитоплазмы - цитохалазина Б, витальное окрашивание и микроскопирование, определяют частоту репродуктивно погибших и выживших потомков хронически облученныхлимфоцитов и при наличии статистически достоверной разницы между контрольными и опытными показателями судят о наследственном клеточно-летальном эффекте неконтролируемого хронического облучения лимфоцитов. Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови детей г. Калинковичи Гомельской области представлена в табл. 1. Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови детей и взрослых г. Минска представлена в табл. 2. Способ реализован следующим образом. Объектом исследования являлась культура лимфоцитов периферической крови 20 детей г. Калинковичи Гомельской области (уровень загрязнения по -137 5 Ки/км 2), а также контрольной группы детей и взрослых г. Минска. 3042 1 Таблица 1 Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови детей г. Калинковичи Гомельской областип/п Всего 1 200 2 200 3 200 4 200 5 200 6 200 7 200 8 200 9 200 10 200 11 200 12 200 13 200 14 200 15 200 16 200 17 200 18 200 19 200 20 200 Суммарные данные 4000 Количество проанализированных клетокклеток М С М живых погибших 42 158 79,0 21,0 39 161 80,5 19,5 49 151 75,5 24,5 37 163 81,5 18,5 54 146 73,0 27,0 35 165 82,5 17,5 48 152 76,0 24,0 31 169 84,5 15,5 45 155 77,5 22,5 37 163 81,5 18,5 41 159 79,5 20,5 52 148 74,0 26,0 49 151 75,5 24,5 37 163 81,5 18,5 34 166 83,0 17,0 28 172 86,0 14,0 51 149 74,5 25,5 45 155 77,5 22,5 39 161 80,5 19,5 48 152 76,0 24,0 841 Оценка пролиферативной гибели лимфоцитов периферической крови детей и взрослых г. Минскап/п Всего 1 2 3 4 5 6 Суммарные данные Количество проанализированных клетокклеток М С М Сживых погибших Дети 10 7 12 5 8 25 Для постановки культуры использовалась цельная кровь, полученная из пальца или методом венопункции. Порции крови в стерильных флаконах с гепарином доставляли к месту постановки эксперимента - в стационарный бокс, работу в котором вели с соблюдением всех правил асептики. Культивирование проводили с использованием модифицированного полумикрометода 5. 3042 1 Удобство метода заключается в том, что для культивирования требуется небольшое, до 0,5 мл, количество цельной крови, которое может быть получено не только методом венопункции, но и из пальца. Лимфоциты культивировали в течение 72 часов в 15 питательной среде, состоящей из среды 1640 фирмы Вектор-Новосибирск, эмбриональной телячьей сыворотки, 0,2 фитогемагглютинина Р фирмы . На 44 часу роста в культуру добавляли блокатор деления цитоплазмы - цитохалазин Б в концентрации 3 мкг/мл. На 72-96 часу от начала культивирования к 0,3 мл культуральной смеси, необходимой для проведения анализа пролиферативной гибели культуры, добавляли 0,5 мл сыворотки для предотвращения агрегации клеток, осторожно ресуспендировали культуру, добавляли 3-5 капель метиленового синего индикатора погибших клеток. Через 30 минут окрашенную суспензию клеток наносили на предметное стекло и подсчитывали число метилен-положительных (Мс) клеток на 100-200 полинуклеарных лимфоцитов,которые легко визуализировались под световым микроскопом с увеличением 2016,5. Число погибших и выживших лимфоцитов выражали как процентМс (Мс-) клеток к общему количеству проанализированных клеток. Данные таблиц 1 и 2 свидетельствуют о том, что использование предложенной модификации выявляет высоко достоверные различия уровня репродуктивной гибели клеток у детей г. Калинковичи и контрольных групп г. Минска. Индивидуальное обследование показало статистически значимое повышение исследуемых показателей в опытных образцах по сравнению с контрольными (примерно в 4-5 раз). Количество репродуктивно погибших клеток у детей г. Калинковичи варьировало от 14,0 до 27,0 среди лимфоцитов, претерпевших несколько делений, тогда как в контрольных группах у детей и взрослых эти показатели изменялись от 2,5 до 12,5 . Анализ среднегрупповых показателей репродуктивной гибели лимфоцитов детей из опытной и двух контрольных групп также подтвердил это заключение 21,00,6 у детей г. Калинковичи, 5,60,7 и 5,30,8 у детей и взрослых г.Минска. Следует отметить, что выбранные нами контрольные группы являются условно-контрольными, так как радиационно-экологическая обстановка в Минске также изменилась после катастрофы на ЧАЭС. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о том, что 1. Результаты обследования детей, подвергающихся длительному неконтролируемому многокомпонентному радиационному воздействию разной интенсивности и продолжительности в районах выпадения радиоактивных осадков, показали высокую эффективность индивидуальной и популяционной биоиндикации облучения по частоте репродуктивной гибели лимфоцитов периферической крови. 2. Использование метиленового синего (МС) позволило провести точный количественный учет живых(МС-) и погибающих или погибших (МС) клеток, которые претерпели несколько делений в условиях цитокинетического блока в культуре лимфоцитов периферической крови. 3. Наличие погибших лимфоцитов, находящихся в , ,и более клеточных циклах, показало, что после хронического облучения могут погибать не только непосредственно облученные клетки, но и их потомки. Использование данного способа позволит 1. Ускорить выявление выживших при культивировании потомков хронически облучаемыхлимфоцитов периферической крови человека. 2. Сократить время на выявление отдаленного эффекта действия хронического облученияна потомство облученных клеток. 3. Оценить косвенно пролиферативные возможности стволовых кроветворных клеток. 4. Проводить профилактику с целью выявления радиационных поражений организма. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66 4