Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях Bacillus subtilis и Escherichia coli (варианты) и способ его конструирования

(51)12 15/63 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(54) ЧЕЛНОЧНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Лагодич Алексей Викторович Титок Марина Алексеевна(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) 1. Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях 7537 1 2005.12.30 репликона плазмиды 21 размером 3,5 , несущего селектируемые маркеры устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу, содержащего единичные сайты узнавания для рестрикционных эндонуклеаз ,136, ,,718,,,, , , , , ,, ,8387, , , локализованные непосредственно передгеном, позволяющие осуществлять клонирование чужеродных молекул ДНК и вести прямую селекцию вставок в клетках Е.на селективной среде, содержащейи -, и репликона криптической резидентной плазмиды 72 природного штамма В.размером 2,1 , обеспечивающим емкость вектора 0,1-10 и репликацию по механизму тета-типа в бактериях В. , клонированного в незначимый участок последовательности плазмиды 21. 2. Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях(56 копий) и(20-30 копий), размером 5,6 , состоящий из колийного репликона плазмиды 21 размером 3,5 , несущего селектируемые маркеры устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу, содержащего единичные сайты узнавания для рестрикционных эндонуклеаз ,136, ,,718,,,, , , , , ,,8387, , , локализованные непосредственно передгеном, позволяющие осуществлять клонирование чужеродных молекул ДНК и вести прямую селекцию вставок в клетках Е.на селективной среде, содержащейи -, и репликона критической резидентной плазмиды 72 природного штамма В.размером 2,1 , обеспечивающим емкость вектора 0,1-10 и репликацию по механизму тета-типа в бактериях В. , клонированного обратно ориентированным в незначимом участке последовательности плазмиды 21. 3. Способ конструирования вектора по пп. 1 и 2, заключающийся в том, что ДНК плазмиды 21 гидролизуют рестриктазой , обрабатывают фрагментом Кленова и соединяют ДНК-лигазой с фрагментом -области плазмиды 72, полученным в результате реакции амплификации, легированной смесью трансформируют клетки В.168, и на среде с хлорамфениколом среди трансформантов отбирают варианты трансформантов, характеризующиеся структурной и сегрегационной стабильностью векторных молекул. Предлагаемое техническое решение относится к химии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биотехнологии для клонирования чужеродных молекул ДНК в системе грамположительных-грамотрицательных бактерий В.- . . В качестве векторов для молекулярного клонирования в бактериях В.широко известны плазмиды, реплицирующиеся по механизму разматывающегося рулона. На основе этих внехромосомных элементов создана серия моно- и бирепликонных векторов общего и специального назначения 1, 2. Недостатком указанных систем является их структурная и сегрегационная нестабильность 3, что ограничивает их использование при клонировании чужеродных фрагментов ДНК размером более 1,7 . В клетках В.не было выявлено собственных плазмид тета-типа, пригодных для создания векторных молекул, поэтому прототипом к предлагаемому техническому решению является создание и использование векторов на основе плазмиды тета-типа 1,выделенной из бактерий, способных стабильно наследоваться в клетках В.со вставками, превышающими размер в 1,71. Векторы, созданные на основе плазмиды 1, представляют собой либо дериват исходной плазмиды, как в случае 1301, либо конструкции, содержащие область репликации плазмиды рАМ 1,обеспечивающую наследование в клетках В. , ген устойчивости к хлорамфениколу плазмиды рС 194 и репликон плазмиды 322, имеющий следующие сайты, пригодные для молекулярного клонирования , , , , , , , ,(показано для вектора 1432). Способ конструирования вектора 1432 заключается 2 7537 1 2005.12.30 в клонировании по -сайту плазмиды 60, несущей ген устойчивости к хлорамфениколу плазмиды рС 194, области репликации плазмиды рАМ 1, ограниченной сайтами узнавания -рестриктазой, с последующей делецией фрагмента, ограниченного сайтами узнаваниярестриктазой 1. Недостатками этой векторной системы являются ограниченное число сайтов для клонирования, отсутствие системы, позволяющей осуществлять прямую селекцию клонированного фрагмента, а также отсутствиерепликона, что не позволяет осуществлять промежуточные этапы клонирования в бактериях . , необходимых на некоторых этапах создания гибридных молекул. Задачей изобретения является создание челночного вектора для молекулярного клонирования в бактериях В.и . , позволяющего клонировать в указанных организмах фрагменты чужеродной ДНК, размером более 1,7 , а также содержащего систему, позволяющую вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках . . Технический результат состоит в конструировании челночного вектора на основе области новой плазмиды тета-типа 72 бактерий В. . Указанная цель достигается тем, что с помощью генно-инженерных методов конструируют вектор для молекулярного клонирования в клетках бактерий В.и . ,способный стабильно наследоваться в указанных хозяевах. Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в незначимую область известного вектора, содержащего -репликон, два маркера антибиотикорезистентности обеспечивающих устойчивость к ампициллину в клетках . , и устойчивость к хлорамфениколу - в бактериях В. , а также полилинкер, содержащий единичные сайты,по которым можно осуществлять клонирование чужеродной ДНК, была осуществлена вставка области плазмиды тета-типа 72, выделенной из бактерий В. , обеспечивающая стабильное поддержание векторной молекулы в системе грамположительных бактерий. Сущность изобретения поясняется фиг. 1 и 2. На фиг. 1 представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого вектора для молекулярного клонирования вариант 1. На фиг. 2 представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого вектора для молекулярного клонирования вариант 2. Предлагаемый вектор включает в себя репликон плазмиды 72 ( и ), позволяющий ему наследоваться в бактериях В. , -репликон , позволяющий ему наследоваться в бактериях . , два маркера антибиотикорезистентности, один их которых экспрессируется в клетках .(устойчивость к ампициллину - ), а второй - в бактериях В.(устойчивость к хлорамфениколу - ), содержит расположенный непосредственно передгеном полилинкерсо следующими сайтами для клонирования фрагментов ДНК , 136, , , 718, , , , , , , , , , , 8387, , , что позволяет осуществлять клонирование чужеродных молекул ДНК размером более 5 , вызывая при этом инактивациюгена, которая обнаруживается в клетках .по возникновению неокрашенных колоний на селективной среде, содержащейи -. Пример 1. В качестве базовой конструкции, обеспечивающей поддержание вектора в системе .используют многокопийную плазмиду 21 4, несущую -репликон, гены антибиотикорезистентности, один из которых экспрессируется в бактериях .(ампициллин), а второй - в бактериях В.- хлорамфеникол. Плазмида 21, кроме вышеперечисленных детерминант, содержит полилинкер, расположенный непосредственно передгеном, что позволяет осуществлять клонирование фрагментов ДНК по ряду сайтов, вызывая при этом инактивациюгена, что в свою очередь может обнаруживаться по возникновению неокрашенных колоний на селективной среде, содержащейи -. 3 7537 1 2005.12.30 В качестве -области, обеспечивающей наследование в бактериях В. , используют фрагмент плазмиды 72 размером 2077 , содержащий -ген и ориджин вегетативной репликации 5. В полимеразной цепной реакции с использованием(Япония) при следующих температурных режимах (94 С - 5 мин (один цикл) 94 С - 10 сек, 50 С - 15 сек,65 С - 4 мин (30 циклов) 4 С - ) получают фрагмент желаемого размера (2077 пар нуклеотидов), который легируют с плазмидой 21, предварительно линиализированной рестриктазойс последующей обработкой фрагментом Кленова. Легированную смесь используют для трансформации бактерий В.168 (2) 6, отбор плазмидсодержащих клонов осуществляют прямой селекцией на среде, содержащей 5 / хлорамфеникола. Отобранные клоны проверяют на способность стабильно наследовать маркер антибиотикорезистентности. Маркер стабильно наследуется в течение 20 генераций. Из отобранных клонов методом щелочного лизиса 7 выделяют плазмидную ДНК, которой трансформируют бактерии . -1 (15 10, 1,1, 96, , , 17 , 44, 1) по стандартной методике 8,из которых также выделяют плазмидную ДНК и путем рестрикционного анализа проверяют их структурную организацию. По результатам последнего отбирают конструкции,размер которых соответствует ожидаемому. Отобранные таким образом конструкции, отличающиеся ориентацией -области плазмиды 72, называют вариант 1 и вариант 2,соответственно. Размер векторов составляет 5,6 .состав полученных конструкций входят репликон плазмиды 21, включающий полилинкер размером 78 р, несущий 16 (вариант 1) и 15 (вариант 2) единичных сайтов, пригодных для молекулярного клонирования и расположенный передгеном, что позволяет вести селекцию вставки на среде, содержащейи -, маркеры устойчивости к ампициллину и хлорамфениколу,выражающиеся в бактериях .и В. , соответственно и -область плазмиды 72, обеспечивающую наследование репликона в клетках В. . Полученные вектора пригодны для молекулярного клонирования в клетках .(20-30 копий) и В.(5-6 копий). Емкость вектора 0,1-10,0 . Спектр хозяев .и В. . Пример 2. Проверку полученных векторов на сегрегационную и структурную стабильность осуществляют путем изучения их наследования в гомогенных и гетерогенных системах 3. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК, выделяемой из клеток .на каждом из этапов, свидетельствует о высоких показателях структурной и сегрегационной стабильности векторов и соответствует 95-100 . Изучение стабильности наследования векторов в клетках В.свидетельствует, что после 20 генераций стабильность наследования составляет 98-100 , а после 60 - 95 . Пример 3. При введении векторов в клетки .и В.путем трансформации частота возникновения трансформантов составляла 106 и 104 клеток на 1 ДНК для .и В. , соответственно. Пример 4. Клонирование фрагмента хромосомальной ДНК штамма 1299 в клетках .и В. . Хромосомальную ДНК штамма 1299, обработанную мелкощепящей рестриктазой 3, легируют с вектором (вариант 1 и 2), предварительно рестрицированным по сайту . Легированной смесью трансформируют клетки . . Селекцию ведут на среде, содержащей - ампициллин в конечной концентрации 50 /. Выделенные векторы несут вставки 4 7537 1 2005.12.30 размером от 1,0 до 2,4 , и сохраняют сегрегационную и структурную стабильность при наследовании в клетках .и В. . Пример 5. Клонирование плазмиды 184 в составе векторов 1 и 2 в клетках .и В. . Плазмиду 184 и ДНК вектора 1 и 2 расщепляют рестриктазойи легируют ДНК-лигазой. Легированной смесью трансформируют клетки . . Селекцию ведут на среде, содержащей -, , ампициллин в конечной концентрации 50 /. Выделенные векторы несут вставку размером 4,24 и сохраняют сегрегационную и структурную стабильность при наследовании в клетках .и В. . Пример 6. Клонирование фрагмента хромосомальной ДНК штамма 1299 в клетках .и В. . Хромосомальную ДНК штамма 1299, обработанную рестриктазой Ва, легируют с вектором (вариант 1 и 2), предварительно порезанными по сайту Ва. С использованием методов,описанных в примере 4, получают векторы, несущие вставки размером от 4,5 до 10,0 ,которые обладают сегрегационной и структурной стабильность при наследовании в клетках .и В. . Таким образом, получен челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях В.и . , позволяющий клонировать в указанных организмах фрагменты чужеродной ДНК размером до 10 и вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках . . 7537 1 2005.12.30 Сиквенс клонированного участка -области плазмиды 72 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.