Штамм бактерий Bacillus subtilis КМБУ 30043 – антагонист фитопатогенных микроорганизмов

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению средств защиты растений, и касается штамма бактерий, который оказывает антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и бактерии и может быть использован в сельском хозяйстве для защиты растений от заболеваний. Известен штамм бактерийдля получения препарата для защиты яблок и винограда от гнили при хранении (А. с. СССР 1706504, МПК А 01 63/00, 1992). Однако данный штамм не предназначен для защиты растений в течение вегетационного периода. Известен штамм бактерий, активный противи некоторых других возбудителей болезней хлопчатника грибной этиологии (А. с. СССР 1717156, МПК А 01 63/00, 1992). Однако он не обладает активностью против бактериальных инфекций. Известен штамм бактерий, активный против возбудителей белой гнили подсолнечника (Патент России 2032345, МПК А 01 63/00, 1995). Недостатком данного штамма является узкий спектр антимикробной активности, особенно в отношении бактериальных инфекций. Известен штаммВКМ -333, активный против фитопатогенных бактерий родов , ,(А. с. СССР 1817875, МПК А 01 63/00, 1995). Однако данный штамм не обладает активностью против возбудителей болезней растений грибной этиологии. Недостатком всех выше перечисленных штаммов является узкий спектр антифунгальной или антибактериальной активности. Наиболее близким к заявляемому является штамм бактерийЦМПМ В-2895, предложенный для борьбы с возбудителем серой гнили земляники. (А. с. СССР 1738200, МПК А 0163/00, 1992). Показана также его активность против ряда других грибов и бактерий. Однако большинство из них не являются фитопатогенными. Кроме того, в отношении указанных микроорганизмов бактерии В. ЦМПМ В-2895 проявляют невысокую антагонистическую активность. Цель изобретения - выделение природного высокоактивного штаммас широким спектром антагонистического действия в отношении фитопатогенных грибов и бактерий. Штамм 494 выделен из почвы в Беларуси в 1994 г. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Белорусского государственного университета под номером КМБУ 30043. 3962 1 ШтаммКМБУ 30043 имеет следующие характеристики. Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные с закругленными концами, 3-5 х 0,50,9 мкм, грамположительные, подвижные. Капсулы не образуют. Споры образуют. Споры эллиптические,расположены центрально, спорангий не раздувают. На агаризованных средах (среде Спицайзена, М 9, МПА) через 24-36 ч образуют макроколонии диаметром 3-4 мм, округлые, беловато-серые, складчатые, с неровным лопастным краем, матовые, непрозрачные. Рост по уколу в МПА умеренный, в основном поверхностный. При культивировании в жидких средах образуют поверхностную пленку, плотную, серовато-белую, складчатую. Хорошо растет на минеральных средах простого состава, не нуждается в добавлении факторов роста и аминокислот. Физиолого-биохимические признаки. По отношению к кислороду - облигатный аэроб. Температурный диапазон роста 15-45 С. Оптимальная температура 30 С. Оптимум рН 6-8. Способен к росту на среде с 10 содержанием . Азот утилизирует в виде солей аммония, нитратов, мочевины. Пигментов не образует. Реакция на оксидазу отрицательная, на каталазу положительная. Реакция Фогеса-Проскауэра положительная. Фенилаланин не дезаминирует. Индол, аммиак, сероводород не образует. Лецитиназная активность отсутствует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Желатину разжижает. Гидролизует крахмал, казеин, целлюлозу, ДНК. Не гидролизует пектин и Твин-80. На среде с 5 сахарозой образует леван. В качестве источника углерода использует арабинозу, фруктозу, галактозу, глюкозу, глицерин, инозит,лактозу, мальтозу, маннозу, раффинозу, сорбит, сахарозу, ксилозу, цитрат, формиат, лактат, сукцинат, этанол. Не утилизирует дульцит, рамнозу, ацетат, тирозин. Штамм чувствителен к хлорамфениколу, налидиксовой кислоте, канамицину, тетрациклину. Устойчив к рифампицину (100 мкг/мл), стрептомицину (50 мкг/мл), ампициллину (50 мкг/мл). Штамм идентифицирован каксогласно определителю(9 .,., . 2, 1989). Штамм хранится на косяках МПА при 4 С с пересевом 1 раз в месяц или на агаризованной среде Спицайзена под слоем стерильного вазелинового масла при той же температуре с пересевом 1 раз в год. Штамм В.КМБУ 30043 не патогенен для растений. Патогенность штамма проверяют с помощью реакции сверхчувствительности на листьях бобов (.). Суспензию клеток штамма (108 клеток в 0.5 мл) в стерильной дистиллированной воде вводят шприцем под кожицу листа. Реакция сверхчувствительности для бактерий В.КМБУ 30043 отрицательная. Штамм В.КМБУ 30043 не патогенен для теплокровных животных. При введении белым мышам массой 16-20 г перорально и внутрибрюшинно по 0.5 мл взеси суточной культуры с титром 109 клеток/мл в 3-кратной повторности при последующем наблюдении в течение 24 суток павших животных не было, поведение и аппетит оставались в норме. Выборочное вскрытие животных показало отсутствие каких-либо скрытых поражений внутренних органов. Штамм В.КМБУ 30043 не фитотоксичен. Фитотоксичность штамма проверяют экспресс-методом на культуре хлореллы ( ). Для этого суспензию клеток хлореллы в стерильной дистиллированной воде вносят в концентрации 106 клеток/мл в расплавленную и охлажденную агаризованную среду с глюкозой (0.2 ) и разливают в чашки Петри. Бактерии В.КМБУ 30043 засевают в виде медальона диаметром 0,5 мм по центру чашки и культивируют в течение 24 ч при 28 С, после чего чашки помещают в светотеплицу и инкубируют на свету при той же температуре 72 ч для роста хлореллы. Отсутствие зон задержки роста водоросли вокруг колонии бактерий В.КМБУ 30043 свидетельствует о его нетоксичности для растений. Штамм В.КМБУ 30043 не снижает всхожести семян сельскохозяйственных растений. Для проверки семена различных растений замачивают в суспензии штамма в концентрации 107 клеток/мл на 1 г сухих семян, помещают во влажную камеру в светотеплицу и проращивают в течение 3-10 суток в зависимости от вида испытуемых растений. В качестве контроля семена замачивают в дистиллированной воде. Всхожесть семян после обработки суспензией штамма В.КМБУ 30043 по сравнению с контролем составляла 100 . Штамм способен к колонизации ризосферы и вегетативных органов растений. Для проверки семена растений перед посевом обрабатывают суспензией суточной культуры бактерий, выращенных на агаризованной глюкозо-солевой среде М 9 при 28 С, с титром 5 х 106 клеток/мл. Обработанные семена выдерживают в течение 48 ч при 28 С, после чего вносят в нестерильную почву и выращивают в течение 2 месяцев. Результаты учитывают через 1, 1,5, и 2 месяца путем определения количества бактерий в средней пробе образцов. Среднюю пробу получают из трех отдельностоящих растений при смешивании их проростков или корней. Из полученного среднего образца делают навеску в 1 г, переносят ее в 5 мл стерильной дистиллированной воды и ресуспендируют. Полученную суспензию из соответствующих разведении высевают по 0.1 мл на селектив 2 3962 1 ную среду со стрептомицином (50 мкг/мл) и культивируют в течение 48 часов при 28 С, затем подсчитывают количество сформировавшихся колоний исследуемых бактерий. Учитывают только те бактериальные колонии, морфология которых не отличается от контроля. Результаты экспериментов представлены в табл. 1. Штамм В.КМБУ 30043 обладает антагонистической активностью в отношении фитопатогенных бактерий родов , , ,и других, в числе которых есть как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. Всего было проверено 190 штаммов, среди которых не было обнаружено ни одного фитопатогенного штамма, устойчивого к действию В.КМБУ 30043. Штамм В.КМБУ 30043 обладает выраженной антифунгальной активностью в отношении фитопатогенных грибов родов , , , , ,и других. Всего было проверено 23 штамма, среди которых также не обнаружено фитопатогенов, устойчивых к действию В.КМБУ 30043. Штамм В.КМБУ 30043 пригоден к использованию в условиях сельскохозяйственного производства. При испытаниях штамма в условиях закрытого и открытого грунта было установлено, что применение препарата В.КМБУ 30043 значительно снижает поражение растений томатов и огурцов бактериозами, вызываемыми,,,., а также грибными инфекциями, вызываемыми,и др. Также отмечен положительный эффект препарата В.КМБУ 30043 в борьбе с инфекционным полеганием сеянцев женьшеня. Полезные свойства штамма В.КМБУ 30043 иллюстрируются следующими примерами. Пример 1. Для изучения антибактериальной активности штамм В. КМБУ 30043 высевают пятнами (диаметр 3-5 мм) на поверхность 1,5 агаризованной среды М 9. Образовавшиеся макроколонии (время инкубации 48 ч при 28 С) обрабатывают парами хлороформа в течение 30мин, проветривают и заливают слоем 0.7 агаризованной среды М 9 с индикаторной культурой фитопатогенных бактерий (0.1 мл индикаторной культуры в стационарной фазе роста на 5 мл охлажденной до 45 С среды). Учет результатов проводят по наличию или отсутствию зон подавления роста индикаторной культуры вокруг макроколоний исследуемого штамма через 24 ч инкубирования при 28 С. Результаты измерений приведены в табл. 2. Пример 2. Для изучения антифунгальной активности штамма В.КМБУ 30043 бактерии высевают на картофельно-глюкозную агаризованную среду кольцом диаметром 40 мм, инкубируют 24 ч при 28 С. В центр сформировавшегося бактериального кольца засевают культуру фитопатогенного гриба, инкубируют при комнатной температуре 25 суток с периодическим учетом диаметра мицелия и характера роста гриба. Затем определяют степень подавления генеративной функции гриба. Для этого делают серию высевов спор, образовавшихся на мицелии, находящемся внутри кольца бактерий. Контролем во всех опытах служат чашки, засеянные чистой культурой гриба. Результаты, представленные в табл. 3 и 4, свидетельствуют о высокой антагонистической активности В.КМБУ 30043 в отношении широкого спектра фитопатогенных грибов. Пример 3. Для проверки эффективности использования препаратаКМБУ 30043 в борьбе с инфекционным полеганием сеянцев женьшеня в условиях открытого грунта бактерии исследуемого штамма выращивают 36 ч при 28 С с аэрацией в жидкой модифицированной среде Спицайзена, содержащейК 2 НР 4 0,7,24 0,35, 4 0,2,цитрат 0,1, О 4720 0,01, глюкозы 0,5. Полученную взвесь с титром -8 х 107 клеток/мл разводят водой в 100 раз. Полученный раствор используют для замочки семян (24 ч) и опрыскивания рассады. Количество обработок за сезон - 3, норма расхода препарата - 3 л/м 2. В результате установлено,что применение препарата В. КМБУ 30043 снижает количество выпадов с 18-23 до 5-7(т.е. в 3-4 раза), а всхожесть обработанных препаратом семян повышается с 64,1 до 83,3 . Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности применения препарата штаммаКМБУ 30043 для профилактики инфекционного полегания женьшеня, где недопустимо использование химических средств защиты растений и фитостимуляторов. Пример 4. Для проверки эффективности применения препарата ВКМБУ 30043 для борьбы с болезнями овощных культур в условиях закрытого грунта в 1995-1996 гг. были проведены испытания препарата в с-зе Минская овощная фабрика и Минском парниково-тепличном комбинате на томатах сортов Рубика и Перамога, огурцах сортов НИИОХ-412 и ТСХА-98. Закладку и проведение эксперимента осуществляли по методике Б. А. Доспехова, учеты на пораженность болезнями - по Методическим указаниям по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур(1985). Препарат .КМБУ 30043 готовят по методике, описанной в Примере 3. Обработка растений включает следующие этапы 3 3962 1 а) замочка семян в препарате (24 ч) б) двукратное опрыскивание рассады в) подлив бактериальной суспензии под корни растений через 12 дней после высадки в грунт г) двукратное опрыскивание вегетирующих растений с интервалом в 15-20 дней, начиная с фазы завязывания плодов. За эталон брали биопрепарат Триходермин и химический препарат Превикур. Результаты испытаний проставлены в табл. 5. Таким образом, штаммКМБУ 30043 обладает выраженной антагонистической активностью против широкого спектра фитопатогенных бактерий и грибов и может успешно использоваться для комплексной защиты сельскохозяйственных культур от болезней. Таблица 1 Способность штамма .КМБУ 30043 к колонизации ризосферы и филлосферы растений Части растения Вегетативные органы Корневая система Спектр антибактериальной активности штамма В.КМБУ 30043 Количество штаммов проверенных чувствительных 4 4 Примечание чувствительными считались культуры с диаметром зон задержки роста 10 мм и более. Таблица 3 Спектр антифунгальной активности штаммаКМБУ 30043 Количество штаммов проверенных чувствительных 4 4 1 1 3 3 4 4 3962 1 Таблица 4 Подавление жизнеспособности спор фитопатогенных грибов штаммомКМБУ 30043 Проба Споры с мицелия, подвергавшегося воздействию В.КМБУ 30043. Споры чистой культуры гриба Интенсивность прорастания спор фитопатогенных грибов,х 106 Таблица 5 Результаты испытаний штаммаКМБУ 30043 в условиях закрытого грунта Заболевание растений и/или возбудитель Бактериальный рак,. Черная ножка,Ложная мучнистая роса,Корневые гнили огурцов Серая гниль томатов Аскохитоз,Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 5