Комбинированная вакцина, способ одновременной комбинированной вакцинации и способ повышения иммуногенности

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ КОМБИНИРОВАННАЯ ВАКЦИНА, СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ ВАКЦИНАЦИИ И СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ(71) Заявитель Американ Цианамид Компани(73) Патентообладатель Американ Цианамид Компани(57) 1. Комбинированная вакцина на основе смеси дифтерийного, столбнячного и коклюшного антигенов с капсульным полисахаридным антигеномтипа , в фармацевтически приемлемом водном носителе, отличающаяся тем, что она содержит капсульный полисахаридный антиген в виде конъюгата с белком 197, при этом компоненты вакцины берут в количествах, обеспечивающих повышенное образование антител к каждому из антигенов. 2. Комбинированная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве дифтерийного и столбнячного антигенов она содержит соответствующие анатоксины, а в качестве коклюшного антигена - инактивированные клетки. 3. Комбинированная вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на фосфате алюминия, а инактивированные клеткив виде суспензии с первичным кислым фосфатом калия, вторичным кислым фосфатом натрия и хлоридом натрия. 4. Способ одновременной комбинированной вакцинации, предусматривающий введение комбинированной вакцины, отличающийся тем, что вводят вакцину по п. 1. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что вводят вакцину по п. 2. 6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что вводят вакцину по п. 3. 7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что вакцину вводят внутримышечно. 8. Способ повышения иммуногенноститипа , дифтерийного антигена, столбнячного антигена и коклюшного антигена - компонентов комбинированной вакцины, отличающийся тем, что вводят разовую дозу комбинированной вакцины по п. 1. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что дифтерийный антиген является дифтерийным анатоксином,столбнячный антиген является столбнячным анатоксином и коклюшный антиген является инактивированными клетками. 10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что дифтерийный анатоксин адсорбирован на фосфате алюминия, столбнячный анатоксин адсорбирован на фосфате алюминия и инактивированные клеткисуспендированы в растворе, содержащем первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат натрия и хлорид натрия. 11. Способ по п. 8, отличающийся тем, что вакцину вводят внутримышечно. Изобретение относится к области медицины, а именно к комбинированной педиатрической вакцине,включающей дифтерийный антиген, столбнячный антиген, коклюшный антиген и конъюгат фрагментов капсульного полисахаридного антигенатипаи дифтерийного белка 197(197) в одной иммунизирующей дозе. Изобретение также относится к способам одновременной комбинированной вакцинации и усиления иммуногенности каждого вакцинного компонента в комбинированной вакцине. Оптимальным возрастом для вакцинации против многих заболеваний является период младенчества и раннего детства. Обычно поэтому во время этого периода назначаются многочисленные прививки в течение короткого отрезка времени. Одновременное введение может снизить затраты, связанные с введением вакцины, увеличить темпы вакцинации и дать возможность ранней и широкоохватной иммунизации детей. Примерами вакцинных комбинаций, используемых для вакцинации детей, являются дифтерийный и столбнячный анатоксины с убитыми целыми клеткамиили с бесклеточными коклюшными антигенами комбинация живых вакцин кори, эпидемического паротита и краснухи (ММР) трех полиомиелитных серотипов, или живых (пероральная полиомиелитная вакцина) или неактивированных(РУ) и комбинация -. В настоящее время практика иммунизации требует вакцинации младенцев раннего возраста, начиная с двухмесячного возраста, как (1) дифтерийным и столбнячным анатоксином и коклюшнойвакциной,так и (2) вакциной конъюгататипа . Двумя такими коммерчески доступными вакцинами являются Т( ) и( , .). Обе эти вакцины рекомендованы для введения в двух-, четырех- и шестимесячном возрасте, с активной иммунизирующей дозой в 15-18 месяцев. Дополнительная дозарекомендуется в 4-6-летнем возрасте. Обе эти вакцины, вводимые раздельно, обеспечили заметный успех в снижении частоты заболеваемости. В то же время было бы желательно объединить в одну вакцинуи конъюгаттипа , чтобы снизить число иммунизаций, которые должен получить ребенок, причем такая комбинация должна иметь приемлемые показатели безвредности и защитной иммуногенности, которые не должны быть меньше, чем у вакцин вводимых отдельно. Комбинированная вакцина на основе смеси дифтерийного, столбнячного и коклюшного антигенов с капсульным полисахаридным антигеномтипа , в фармацевтически приемлемом водном носителе, согласно изобретению, содержит капсульный полисахаридный антиген в виде конъюгата с белком 197, при этом компоненты вакцины берут в количествах, обеспечивающих повышенное образование антител к каждому из антигенов. В качестве дифтерийного и столбнячного антигенов вакцина содержит соответствующие анатоксины, а в качестве коклюшного антигена - инактивированные клетки. В частности, вакцина содержит дифтерийный и столбнячный анатоксины, адсорбированные на фосфате алюминия, а инактивированные клеткив виде суспензии с первичным кислым фосфатом калия, вторичным кислым фосфатом натрия и хлоридом натрия. Согласно изобретению, предложен способ одновременной комбинированной вакцинации, предусматривающий введение указанной комбинированной вакцины внутримышечно, а также способ повышения иммуногенноститипа , дифтерийного антигена, столбнячного антигена и коклюшного антигена - компонентов комбинированной вакцины - путем введения разовой дозы комбинированной вакцины. Дифтерийный антиген является дифтерийным анатоксином, столбнячный антиген является столбнячным анатоксином и коклюшный антиген является инактивированными клетками. Дифтерийный анатоксин адсорбирован на фосфате алюминия, столбнячный анатоксин адсорбирован на фосфате алюминия и инактивированные клеткисуспендированы в растворе, содержащем первичный кислый фосфат калия, вторичный кислый фосфат натрия и хлорид натрия. Комбинированная педиатрическая вакцина настоящего изобретения содержит дифтерийный, столбнячный и коклюшный антигены, смешанные с конъюгатом фрагментов капсульных полисахаридовтипа , ковалентно связанных с 197. При предпочтительном осуществлении дифтерийный антиген является дифтерийным анатоксином, адсорбированным фосфатом алюминия, и столбнячный антиген является столбнячным анатоксином, адсорбированным фосфатом алюминия. Эти анатоксины могут быть получены хорошо известными в данной области способами. Дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин получают изисоответственно, которые выращиваются в среде по методу Мюллера - Миллера, ., 1941, 4021-32 и ., 1947, 56143-147, и детоксифицируют с помощью формальдегида. Анатоксины очищаются по методу спиртового фракционирования Пиллемера., ., 1946, 54213-224 и разводятся водным раствором, содержащим одноосновной фосфат натрия, двуосновной фосфат натрия, глицин и тимерозал (ртутное производное) в качестве консерванта. 2 3549 1 Коклюшный антиген является предпочтительно препаратом целых инактивированных клеток одного штамма или комбинации штаммов. Инактивированный препарат целых коклюшных клеток получают путем выращиванияфазы 1 в модифицированном бульоне -,содержащем кислотный гидролизат казеина.инактивируется тимеросалом, отделяется и затем суспендируется в водном растворе, содержащем моноосновной фосфат калия, двухосновной фосфат натрия, хлорид натрия и тимеросал (ртутное производное) в качестве консерванта. Компонентымогут быть представлены в виде смеси. Например, коммерчески доступный препарат, такой, как поставляемыйпод названием - может быть использован для композиции комбинированной вакцины настоящего изобретения. Конъюгатный компоненткомбинированной вакцины настоящего изобретения содержит фрагменты бактериального капсульного полисахаридатипа , ковалентно связанные с белком 197. Фрагменты получают путем постепенного расщепления очищенного капсульного полисахарида, выделенного изтипавыращенной в химически определенной среде. Белок 197 является нетоксичным вариантом дифтерийного токсина, выделенного из культур С.штамма С 7 (бета 197), выращенных в среде на основе казаминокислот и дрожжевого экстракта, фрагментытипасоединяли с белком 197 путем ковалентного связывания. Особенно предпочтителен способ ковалентного связывания сахарида с белком - восстановительное аминирование. Получение конъюгатовтипаи СМ 197 путем восстановительного аминирования описано в патентах 3, 6 и 4 902 506. Конъюгат очищают путем диафильтрации, чтобы удалить непрореагировавший белок или полисахаридные фрагменты и реагенты, и стерилизуют фильтрованием. Коммерчески доступный конъюгаттипа , такой, как поставляемый, ., под названием , может быть использован для композиции комбинированной вакцины настоящего изобретения. Комбинированная вакцина настоящего изобретения получается путем добавления концентрата конъюгататипак препарату , когда вакцинаразбавляется доведением до окончательного объема. Окончательная иммунизирующая доза поэтому остается в объеме 0,5 мл. Каждая единичная доза в 0,5 мл комбинированной вакцины составляется так, что она содержит минимум 7,5 дифтерийного анатоксина, 5 столбнячного анатоксина (оба анатоксина индуцируют образование не менее чем 2 единиц антитоксина на мл при определении эффективности на морских свинках), 10 мкг очищенного сахаридатипаи примерно 25 мкг белка 197. Каждая доза вакцины составляется так, чтобы содержать менее 16 инактивированных коклюшных клеток. Общая иммунизирующая доза (первые три вводимые дозы по 0,5 мл) для людей содержит по оценке 12 единиц коклюшной вакцины с оценкой в 4 защитных единицы на одну человеческую дозу. Каждый компонент вакцины - дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, коклюшный и конъюгаттипа- удовлетворяет стандартам необходимой активности. В качестве консерванта добавляется тимеросал (ртутное производное) к комбинированной вакцине до конечной концентрации 110000. Содержание алюминия в дозе окончательного продукта не превышает 0,85 мг на 0,5 мл дозу по результатам определения. Остаточное содержание свободного формальдегида по результатам исследований 0,02 . Комбинированная вакцина, содержащая каждый из четырех вакцинных компонентов (, Т, Р и конъюгат) получается в виде водной композиции. После взбалтывания вакцина представляет собой гомогенную белую суспензию. В комбинированную вакцину могут также включаться подходящие вакцинные адъюванты. Вакцина вводится внутримышечно. Четырехкомпонентную комбинированную вакцину получали как описано выше, используя(,) и конъюгат(,). Повышенная иммуногенность каждого из четырех компонентов в комбинированной вакцине была показана при клинических испытаниях. Изучение безопасности и иммуногенности было проведено у начинающих ходить детей и младенцев при участии многих медцентров. Кроме того, было проведено широкомасштабное исследование безопасности применения комбинированных вакцин у младенцев, чтобы оценить появление редких побочных явлений на большом числе субъектов. Для обоих исследований, по безвредности и иммуногенности у детей, начинающих ходить, и младенцев, субъекты для введения или единственной дозы 0,5 мл, или одной из трех последовательных в серии введений четырехкомпонентной вакцины (, Т, Р и конъюгатобъединенные) или дозы 0,5 мл для каждой изи конъюгатнойвакцин, выбранных из одной из трех соответствующих серийи конъюгата , вводимых одновременно в виде отдельных инъекций ( и конъюгатотдельно) в возрасте 183 месяца или в примерно 2-, 4-, и 6 месячном возрасте, отбирались по методу случайной выборки. Таким образом, субъекты относились по методу случайной выборки. Таким образом, субъекты относились к одной из шести групп, проходивших курс профилактики. Безвредность при остром воздействии вакцины оценивали по сообщениям родителей о побочных эффектах в течение 72 ч после каждой иммунизации. Иммуногенность определяли с помощью серологического анализа на антитела к полисахаридутипа(полисахаридудифтерийных, столбнячных и коклюшных). 3 3549 1 Протокол каждой стадии анализировали независимо. Первичный анализ данных по безвредности и иммуногенности позволил заключить, что все три последовательных серии четырехкомпонентной комбинированной вакцины были сходны по всем испытанным параметрам и, таким образом, данные объединялись. Это же наблюдалось и для трех соответствующих серийи конъюгата , которые вводили одновременно в виде раздельных инъекций. а. Исследование безвредности и иммуногенности для детей, начинающих ходить. В протокол исследования у детей, начинающих ходить, были включены общим числом 215 субъектов(для комбинированной вакцины 107, для -конъюгатотдельно 108), отобранные в каждом лечебном учреждении из 4 по методу случайной выборки. Демографические характеристики всех субъектов были сходными. Серологический анализ образцов сыворотки до и спустя месяц после иммунизации не выявил различий в реакции на полисахариддифтерию или столбняк (табл. 1). Однако антительная реакция на коклюшные агглютинины была значительно выше в группе, получившей комбинированную вакцину (142, 58), по сравнению с группой, получавшей -конъюгатотдельно (82,44 р 0,013). б. Исследование безвредности и иммуногенности для младенцев. В протокол исследования младенцев было включено 378 субъектов (для комбинированной вакцины 189, для-конъюгатотдельно 189) и отобраны по методу случайной выборки в каждом из пяти клинических учреждений. Демографические характеристики всех субъектов были сходными. Реакция на полисахаридпосле каждой из трех иммунизаций была выше у субъектов, получавших комбинированную вакцину (табл. 2). После двух доз среднее геометрическое значение титра (СГТ) в группе комбинированной вакцинации составила 0,66 мкг/мл по сравнению с 0,34 мкг/мл в группе, получавшейконъюгатотдельно (р 0,001). Та же самая тенденция наблюдалась после третьей дозы, 6,67 мкг/мл по сравнению с 4,42 мкг/мл для комбинированной вакцины и -конъюгатаотдельных вакцин, соответственно (р 0,034). Серологическую реакцию на компонентыопределяли через месяц после введения третьей дозы, СГТ антител к дифтерии (0,71 /мл против 0,40 /мл р 0,009), столбняка (8,20 против 4,51 р 0,001) и коклюшным агглютининам (51,93 против 23,34 р 0,008) был во всех случаях значительно выше в группе, получавшей комбинированную вакцину по сравнению с группой, получавшей раздельное введение, соответственно (табл. 2). В случаях дифтерии и коклюше это различие терялось, если сравнивали отношение реакции к основному титру. Сыворотку субпопуляции анализировали на антитела к специфическим коклюшным антигенам, коклюшному токсину (КТ),и белку 69 К. Реакция на КТ (85,92 против 17,60 р 0,001) и(2,32 против 0,79 р 0,0001) была значительно выше в группе, получавшей комбинированную вакцину по сравнению с группой, получавшей раздельное введение, соответственно(табл. 3). Однако никакого различия не наблюдалось для 69 К (комбинированная вакцина 66,43 против 41,55 р 0,11 при раздельном введении). в. Широкомасштабное исследование безвредности и иммуногенности для младенцев в субпопуляциях. Широкомасштабное исследование безопасности для младенцев было проведено в рамкахСаге. Это исследование проводилось по плану как со случайной, так и с неслучайной выборкой. Первая выборка позволяла накопить данные по применению комбинированной вакцины у большого числа субъектов (5777). Последняя выборка являлась контролем, при котором безвредность комбинированной вакцины (720) могла перспективно сравниваться с безвредностью в группе, получавшей конъюгат(691) одновременно в виде отдельных инфекций. Таким образом, 3 дозы комбинированной вакцины (, Т, Р и конъюгатобъединенных) получили всего 6497 субъектов возрастом примерно 2, 4 и 6 месяцев. Частоту местных и системных явлений определяли в течение 24 ч иммунизации. Редкие проявления, такие, как припадки, оценивались путем определения числа госпитализаций в течение 60 дней и вызовов скорой помощи на дом в течение 30 дней иммунизации. Для трех рассмотренных серий местные и системные реакции не встречались закономерно более часто после применения комбинированной вакцины по сравнению с одной . Кроме того, не существует значительного различия для частот побочных явлений, связанных с применением лекарственных средств, наблюдаемых при госпитализации или вызовах скорой помощи. Уровень смертности от синдрома внезапной смерти младенцев был несколько ниже в группе комбинированной вакцины, чем в контрольной группе. Антительные реакции на полисахариддифтерию, столбняк и коклюш определяли через месяц после введения третьей дозы комбинированной вакцины у субпопуляции из 123 субъектов. Полученные значения были сравнимы со значениями, полученными при изучении безопасности и иммуногенности у младенцев с участием многих медцентров, описанном выше (табл. 4). г. Серологические методики. Серологические исследования выполняли с помощьюна антитела к полисахаридутипаи столбнячные (в исследованиях у младенцев), путем определения с клетками ( (. . 2189-201. . 2203-209) на дифтерийные антитела, по методу летальности мышей (.43453-459,15, 1953, .., 1986,,408-414 3 ). 3549 1 На столбнячные антитела (исследование у детей, начинающих ходить) и путем пробы микроагглютинации (а 1., 1986,,388-394, 3 ), на коклюшные антитела. Как будет ясно из данных клинического изучения, представленных здесь, реакция у младенцев на каждый из вакцинных компонентов была выше в случае комбинированной вакцины, чем при одновременном, но раздельном введениии конъюгатавакцин. Использование такой комбинированной вакцины, таким образом, может вдвое уменьшить количество прививок, получаемых младенцами, и является поэтому важным шагом в направлении улучшения проведения вакцинации. Таблица 1 Сравнение образования антител комбинированной и отдельным вакцинам 1 Компонент 2( ) Конъюгат(мкг/мл) до после Дифтерия (/мл) до после Столбняк (ЕД/мл) до после Коклюшные агглютинины (эквивалентное разведение) до после 1. Комбинированная четырехкомпонентная (, Т, Р и конъюгат Н) вакцина или отдельные (конъюгат ) вакцины вводили в возрасте 15-18 месяцев с отбором крови для серологии через месяц. 2. Общее число включенных субъектов. 3. Основано на эффектах в первичной (ковариантно скорректированной) модели, включая вакцинацию,медцентр, серию, возраст, исходный уровень антител. Образование антител при сравнении комбинированной и отдельных вакцинин 1 Компонент 1. Комбинированная четырехкомпонентная (, Т, Р и конъюгат ) вакцина или отдельные (конъюгат) вакцины вводили в возрасте 2, 4 и 6 месяцев. 2. Общее число включенных субъектов. 3. Основано на эффектах в первичной (ковариантно скорректированной) модели, включая вакцинацию,медцентр, серию, возраст, исходный уровень антител. 5 3549 1 Таблица 3 Образование антител к трем компонентам коклюшной вакцины в группах, получавших комбинированную и отдельные вакцины Компонент Коклюшный токсин до после 3 69 К до после 3 1. Титры антител представлены в единицахна мл. 2. Значения р рассчитывали, используя тестдля двух образцов. Таблица 4 Образование антител к каждому компоненту комбинированной ( и конъюгат ) вакцины Компонент Конъюгат(мкг/мл) Дифтерия (/мл) Столбняк (ЕД/мл) Коклюшные агглютинины (эквивалентное разведение) 1. Титры антител через один месяц после третьей дозы, ни одной сыворотки до иммунизации не было получено. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 6