Способ коррекции фосфолипидного спектра мембран митохондрий печени после хирургического лечения распространенного гнойного перитонита у кролика в эксперименте

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ФОСФОЛИПИДНОГО СПЕКТРА МЕМБРАН МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ РАСПРОСТРАНЕННОГО ГНОЙНОГО ПЕРИТОНИТА У КРОЛИКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Косинец Владимир Александрович Осочук Сергей Стефанович Яроцкая Наталья Николаевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ коррекции фосфолипидного спектра мембран митохондрий печени после хирургического лечения распространенного гнойного перитонита у кролика в эксперименте,заключающийся в том, что в первые 5 суток послеоперационного периода вводят внутривенно цитофлавин из расчета 28 мг янтарной кислоты на кг массы тела в сутки. Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и применяется для коррекции фосфолипидых соотношений мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Нарушение структурно-функциональной целостности биологических мембран лежит в основе многих патологических процессов. Формируя гидрофобную защитную среду, липиды регулируют конформацию белков,выступают в роли кофакторов ферментов, участвуют в ионнообменном и субстратном транспорте 1. Энергозависимость многочисленных метаболических процессов, протекающих в клетке, определяет центральное значение эффективности окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ (адинозинтрифосфорная кислота) в митохондриях. Функционирование митохондриального аппарата имеет неразрывную связь с интегральной целостностью его структурных компонентов, важнейшими из которых являются липиды 2. Воздействие повреждающих факторов может приводить как к компенсаторной, так и к патологической модификации липидного соотношения мембран. Энергодефицит в результате нарушения процесса окислительного фосфорилирования и активация на его фоне перекисного окисления липидов, рост активности фосфолиполизы 2 вызывают каскад 18631 1 2014.10.30 патологических реакций, повреждение мембранной структуры митохондрий, апоптоз клетки 3. Аналогом предлагаемого изобретения является применение в качестве мембранотропного соединения креатинфосфата, который способен оказывать модифицирующее действие на липидный бислой мембран эритроцитов, липосом 4. Прототипа данного изобретения не обнаружено. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа коррекции соотношения фосфолипидов мембран митохондрий печени, позволяющего предотвратить патологические изменения при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Реализация данной задачи достигается внутривенным введением в течение 5-ти суток метаболического средства Цитофлавин, содержащего янтарную кислоту, из расчета в сутки 28 мг кислоты на килограмм массы. Цитофлавин - многокомпонентный препарат, в состав которого входят янтарная кислота, рибоксин, инозин и никотинамид. Цитофлавин применяется только внутривенно капельно в разведении на 5-10 растворе глюкозы или 0,9 растворе натрия хлорида. В условиях стресса и воспаления окисление янтарной кислоты в митохондриях является основным и наиболее эффективным путем обеспечения клетки энергией макроэргических соединений 5. Известно, что в микроконцентрациях янтарная кислота представляет собой не столько субстрат второго комплекса дыхательной цепи митохондрий,сколько сигнальную молекулу, обладающую гормоноподобным действием, направленным на стимуляцию адаптации и активацию резервных возможностей организма 6. Другие компоненты препарата также относятся к активным метаболическим составляющим. Так, инозин, производное пурина, является предшественником АТФ, активирует ряд ферментов цикла Кребса и стимулирует синтез нуклеотидов. Рибофлавин - главный компонент флавиновых коферментов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях дыхательной цепи митохондрий. Никотинамид путем влияния на соотношение НАДН/НАД(никотинамидадениндинуклеотид) играет важную роль в регуляции работы цикла Кребса, а соответственно, и окислительного фосфорилирования. Изучение влияния препарата Цитофлавин на состав фосфолипидов мембран митохондрий печени при экспериментальном лечении распространенного гнойного перитонита проводилось на кроликах-самцах породы шиншилла. Изобретение поясняется следующими материалами. В таблице отражены данные спектра фосфолипидов мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Эксперимент выполнен на 55 кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы- интактные (5)- 6-часовой распространенный гнойный перитонит без хирургического лечения (5)- контрольная, хирургическое лечение перитонита (15)- хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде препарата Цитофлавин (15)- хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде препарата Неотон (15). Перитонит моделируют путем интраабдоминального введения аэробно-анаэробной взвеси . (штамм 0111 К 58 НИ С 130-53) и . (штамм 323) из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Через 6 ч после введения микроорганизмов в ,игруппах животных с целью лечения перитонита и устранения энтеральной недостаточности выполняют лапаротомию, санацию брюшной полости, декомпрессию тонкой кишки. Животнымигрупп в послеоперационном периоде (в течение 5-ти суток) ежедневно внутривенно капельно вводят препараты Цитофлавин (28,6 мг янтарной кислоты на 1 кг массы) и Неотон (0,05 г на 1 кг массы) соответственно, животнымгруппы - физиологический раствор натрия хлорида 0,9 . Животных с распространенным гнойным перитонитом выводят из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 ч после заражения, ,игрупп - на 1, 3 и 5 сутки после операции. 2 18631 1 2014.10.30 Белок определяют биуретовым методом 7. Выделение митохондрий печени выполняют по методу - 8. Экстракцию фосфолипидов (ФЛ) митохондриальных мембран осуществляют последовательно смесью хлороформ/метанол (12 по объему) и смесью хлороформ/метанол/вода (120,8 по объему) согласно методике М. Кейтс 9. Суммарную концентрацию ФЛ митохондрий печени измеряют после минерализации экстракта по реакции с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой 10 по стандарту неорганического фосфата. Классы ФЛ разделяют методом тонкослойной хроматографии 9. Идентификацию ФЛ классов проводят по стандартам после окрашивания в йодной камере. Содержание ФЛ классов определяют по неорганическому фосфату в реакции с реактивом Васьковского и выражают в процентах от общего количества 11. Статистическую обработку данных проводят с использованием электронных пакетов анализа 6.0 и . На основании нормального распределения значений признаков в группах используют методы описательной статистики,- критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений 0,05). Через 6 ч после инициации распространенного гнойного перитонита в митохондриях печени по сравнению с нормой отмечалось достоверное увеличение процентного содержания лизофосфатидов (ЛФ) и кардиолипина (КЛ) с 11,040,90 до 13,541,79 (0,006) и 10,770,61 до 11,991,26 (0,04) соответственно, а также снижение уровня полиглицерофосфатидов (ПГФ) с 18,261,59 до 15,271,01 (0,001) (таблица). Статистически достоверных изменений содержания фосфатидиламина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина выявлено не было. На 1 сутки послеоперационного периода в контрольной группе, по сравнению с интактными животными, отмечался рост процентного содержания ЛФ и КЛ до 14,571,32(0,0001) и 11,580,46 (0,02) соответственно. Сохранялся низкий уровень ПГФ 15,922,06 (0,04). Описанные изменения следует расценивать как негативно-компенсаторные, поскольку рост содержания ЛФ, способствующих дестабилизации мембран, компенсирован увеличением содержания КЛ, участвующего в формировании комплексов дыхательной цепи и поддержании трансмембранного потенциала, а также предотвращающего осмотическую неустойчивость и разобщение окислительного фосфорилирования при увеличении функциональной нагрузки. На 3 сутки после операции процентное содержание КЛ составило 10,130,97, при этом количество ЛФ оставалось повышенным - 13,941,16 и достоверно превышало показатель нормы (0,0003). Содержание ПГФ было ниже, чем у интактных животных (0,04). Динамика изменения спектра фосфолипидов свидетельствовала о снижении адаптационной способности митохондрий. Исследование фосфолипидного спектра митохондрий на 5 сутки послеоперационного периода подтвердило данное предположение, поскольку отмечалось достоверное, по сравнению со здоровыми животными (0,002), снижение содержания КЛ до 9,520,62. Содержание лизофосфатидов сохранялось на прежнем высоком уровне и составило 13,840,39 (0,0001) Применение препарата Цитофлавин, содержащего янтарную кислоту, препятствовало развитию характерных для распространенного гнойного перитонита сдвигов в спектре фосфолипидов митохондрий печени. На 1 сутки после операционного вмешательства содержание ЛФ, ПГФ и КЛ не отличалось от такового у здоровых животных. При этом содержание ЛФ было достоверно ниже - 11,451,08 (0,001), а ПГФ - выше - 18,770,56(0,008), чем у животных контрольной группы. Содержание КЛ составило 11,81,71 и недостоверно превышало показатель нормы. На 3 сутки послеоперационного периода отмечался незначительный рост уровня лизофосфатидов до 11,941,02, и снижение содержания полиглицирофосфатидов и кардио 3 18631 1 2014.10.30 липина до 18,211,48 и 10,430,91 соответственно. Тем не менее, несмотря на указанные изменения, данные показатели, по-прежнему статистически достоверно отличались от таковых у группы животных, где препарат не применялся. На 5 сутки после операции содержание лизофосфатидов и полиглицерофосфатидов в митохондриях печени животных, которые получали Цитофлавин, не имело достоверных отличий от показателей интактных животных и составило 10,530,44 и 18,461,21 соответственно. В то же время отмечался статистически значимый по сравнению с нормой рост уровня кардиолипина до 12,20075 (0,002). Динамика изменений спектра фосфолипидов митохондрий печени группы животных,которые получали препарат Неотон, во все сроки исследований была сходна с таковой при применении препарата Цитофлавин, однако менее выраженной. На 1 сутки послеоперационного периода уровень лизофосфатидов составил 11,550,89,полиглицирофосфатидов и кардиолипина - 18,41,78 и 11,891,44 соответственно. На 5 сутки после операции показатели на фоне препарата Неотон не отличались от нормы,за исключением КЛ, содержание которого было выше (0,022), чем у интактных животных ЛФ - 11,290,60, ПГФ и КЛ - 18,191,38 и 12,161,22 соответственно. Однако уровень лизофосфатидов был достоверно выше (0,02), чем в группе, где применялся Цитофлавин. Таким образом, установлено, что развитие распространенного гнойного перитонита вызывает негативные изменения в фосфолипидном спектре митохондрий печени с увеличением содержания лизофосфатидов на 22,64(0,0001), компенсированного ростом уровня кардиолипина за счет снижения содержания полиглицерофосфатидов хирургическое лечение распространенного гнойного перитонита, включающее санацию брюшной полости и декомпрессию тонкой кишки, не способно предотвратить негативную тенденцию патологических изменений фосфолипидного спектра мембран митохондрий печени. 5 сутки послеоперационного периода характеризуются истощением компенсаторных систем, заключающимся в снижении содержания КЛ, по сравнению с нормой, на 11,6(0,002) и сохранением повышенного на 25,4 содержания ЛФ(0,0001) применение препарата фосфокреатина Неотон при лечении экспериментального распространенного гнойного перитонита позволяет предотвращать патологические негативные изменения соотношения состава фосфолипидов мембран митохондрий печени. По сравнению с контрольной группой, на 5 сутки послеоперационного периода процентное содержание в митохондриях печени кардиолипина - 27,8(0,0004), уровень лизофосфатидов был ниже на 18,4(0,0001). Цитофлавин, содержащий янтарную кислоту, обладает более выраженными, по сравнению с препаратом Неотон, свойствами защиты фосфолипидного спектра мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните за счет интенсивного снижения на 5 сутки послеоперационного периода уровня лизофосфатидов на 6,73(0,02). Положительным эффектом данного изобретения является то, что применение метаболического средства Цитофлавин препятствует развитию негативных изменений в спектре фосфолипидов мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните, способствуя сохранению нормального соотношения фосфолипидов,начиная с 1 суток послеоперационного периода. Спектр фосфолипидов мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Примечание 1 - по сравнению с нормой 2 - по сравнению с группой 6-часовой перитонит 3 - по сравнению с группой без лечения аналогичных суток 4 - по сравнению с группой Неотон аналогичных суток. Группа С применением препарата С применением препарата Контрольная Неотон Цитофлавин 1 сутки 3 сутки 5 сутки 1 сутки 3 сутки 5 сутки 1 сутки 3 сутки 5 сутки//. - 1991. - . 56. . 1701-1709 (прототип). 5. Кондрашова М.Н. Янтарная кислота - источник энергии в организме. // Норма-пресс. 1991. -9. - С. 17-18. 6. Кондрашова М.Н. Гормоноподобное действие янтарной кислоты // Вопросы биологической, медицинской, фармацевтической химии. - 2002. -1.- С. 7-12. 7.,,// . . . - 1949. - . 177. - . 751-766. 8..,. -, 1967. - . 10. - . 94-96. 9. Кейтс М. Техника липидологии. - . Мир, 1975. - . 76, 138-140, 310-311. 10..,., ,//. . - 1961. - . 169. - . 43-46. 11.,,// . . - 1975. - . 114. - . 129-141. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.