Способ коррекции белково-фосфолипидного состава мембран митохондрий печени после хирургического лечения распространенного гнойного перитонита у кролика в эксперименте

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КОРРЕКЦИИ БЕЛКОВО-ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ РАСПРОСТРАНЕННОГО ГНОЙНОГО ПЕРИТОНИТА У КРОЛИКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Косинец Владимир Александрович Осочук Сергей Стефанович Яроцкая Наталья Николаевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ коррекции белково-фосфолипидного состава мембран митохондрий печени после хирургического лечения распространенного гнойного перитонита у кролика в эксперименте, заключающийся в том, что в первые 5 суток послеоперационного периода вводят внутривенно капельно омегавен в дозе 2 мл на 1 кг массы кролика в сутки. Изобретение относится к области медицины, а именно хирургии, для коррекции белково-фосфолипидых соотношений мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. В настоящее время развитие и течение распространенного гнойного перитонита неразрывно связано с понятием абдоминальный сепсис и рассматривается как тяжелое системное воспалительное заболевание 1. Гиперкатаболический сдвиг обменных процессов обуславливает рост потребности организма в энергетических и пластических субстратах 2. В условиях тканевой гипоксии, интоксикации и действия совокупности других повреждающих факторов значительно страдает структурная и функциональная организация клеток 3. Нарушение целостности митохондриальных мембран является одним из ключевых звеньев дефицита энергетического обеспечения. Дестабилизация липидного слоя с ростом протонной проницаемости мембран и выравниванием трансмембранного потенциала служат причиной снижения эффективности окислительного фосфорилирования и синтеза АТФ (аденозинтрифосфорная кислота) 4, 5. В настоящее время большое внимание уделяется вопросам лечебного питания в терапии критических состояний. Широкое распространение получили жировые эмульсии для парентерального питания на основе соевого масла (Интралипид, Липовеноз). Недостатком данных препаратов является отсутствие структурированности триглицеридов, а также четкого выделения наличия в составе полиненасыщенных жирных кислот 6. 18379 1 2014.06.30 Полиненасыщенные жирные кислоты являются важными компонентами фосфолипидов всех клеточных мембран. Сбалансированный состав жирных кислот фосфолипидов важен для адекватного функционирования мембран. Изменения в составе клеточной мембраны влияют на ее текучесть и такие функции, как ферментная активность, передача импульсов и работа рецепторов. Полиненасыщенные жирные кислоты также служат предшественниками для синтеза липидных медиаторов (например, простагландинов и лейкотриенов), которые являются важными регуляторами ряда физиологических процессов. Значительный интерес представляет изучение свойств омега-3 жирных кислот, среди которых наибольшей биологической активностью обладают эйкозапентаноевая и докозогексаеновая кислоты. Препараты на основе указанных соединений оказывают противовоспалительное действие путем снижения продукции провоспалительных простагландинов и лейкотриенов, ограничения миграционной активности лейкоцитов 7, 8. Установлено,что экзогенные омега-3 жирные кислоты способны быстро встраиваться в мембранные фосфолипиды, в том числе иммунокомпетентных клеток 9. Фосфолипиды, обогащенные эйкозапентаноевой кислотой, обеспечивают параметры текучести мембран, а также влияют на транспорт протонов дыхательной цепи 10. Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа коррекции нарушений белково-фосфолипидного состава мембран митохондрий печени, вызванных экспериментальным распространенным гнойным перитонитом, позволяющего предотвратить патологические изменения белково-фосфолипидных соотношений мембран митохондрий печени. Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что применение эмульсии для инфузий Омегавен, содержащей омега-3 жирные кислоты, предотвращает накопление в мембранах митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните лизофосфатидов, обладающих детергентными свойствами, способствует увеличению процентного содержания полиглицерофосфатидов и, в частности, кардиолипина фосфолипида, оказывающего непосредственное влияние на процессы окислительного фосфорилирования и апоптоза, а также росту количества белка. Изобретение поясняется следующими материалами. Таблица. Динамика белково-липидного состава и спектра фосфолипидов мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Эксперимент выполнен на 40 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы- интактные (5)- 6-часовой распространенный гнойный перитонит без хирургического лечения (5)- контрольная, хирургическое лечение перитонита (15)- хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде препарата Омегавен (15). Перитонит моделируют путем интраабдоминального введения аэробно-анаэробной взвеси . (штамм 0111 К 58 НИ С 130-53) и . (штамм 323) из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Через 6 ч после введения микроорганизмов в -ей и -ой группах животных с целью лечения перитонита и устранения энтеральной недостаточности выполняют лапаротомию, санацию брюшной полости, декомпрессию тонкой кишки. Животным -ой группы в послеоперационном периоде (в течение 5-ти суток) ежедневно внутривенно капельно вводят препарат Омегавен (2 мл на 1 кг массы), животным -ей группы - раствор натрия хлорида 0,9 . Животных с распространенным гнойным перитонитом выводят из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 ч после заражения, -ей и -ой групп - на 1-е, 3-и и 5-е сутки после операции. Выделение митохондрий печени выполняют по методу - 11. Экстракцию фосфолипидов (ФЛ) митохондриальных мембран осуществляют последовательно смесью хлороформ/метанол (12 по объему) и смесью хлороформ/метанол/вода (120,8 по объему) согласно методике М. Кейтс 12. Суммарную концентрацию ФЛ митохондрий печени измеряют после минерализации экстракта по реакции с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой 13 по стандарту неорганического фосфата. Индивидуальные ФЛ разделяют методом тонкослойной хроматографии 12. Идентификацию ФЛ классов про 2 18379 1 2014.06.30 водят по стандартам после окрашивания в йодной камере. Содержание ФЛ классов определяют по неорганическому фосфату в реакции с реактивом Васьковского и выражают в процентах от общего количества 14. Белок определяют биуретовым методом 15. Статистическую обработку данных проводят с использованием электронных пакетов анализа 6.0 и . Поскольку распределение признаков носит правильный характер, а дисперсии в сравниваемых группах не отличались, были использованы методы описательной статистики, -критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений р 0,05). По результатам эксперимента через 6 ч после инициации распространенного гнойного перитонита в митохондриях печени, по сравнению с нормой, отмечалось достоверное увеличение процентного содержания лизофосфатидов (ЛФ) и кардиолипина (КЛ) с 11,040,90 до 13,541,79 (р 0,006) и 10,770,61 до 11,991,26 (р 0,04) соответственно, а также снижение уровня полиглицерофосфатидов (ПГФ) с 18,261,59 до 15,271,01 (р 0,001)(таблица). Статистически значимых изменений содержания фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина выявлено не было. Наблюдалось достоверное, по сравнению с нормой, снижение содержания общих фосфолипидов (ОФЛ) и холестерола(ХС) (в пересчете на 1 г белка) с 27,371,24 и 12,510,78 до 17,231,40 (р 0,0001) и 5,281,48 (р 0,0001) соответственно. В то же время отмечался рост соотношения ОФЛ/ХС(р 0,021), которое составило 3,330,88. Рост отношения ОФЛ/ХС может быть обусловлен дисбалансом между образованием и оттоком ЛФ, а накопление ЛФ на фоне снижения содержания ХС расценено как негативный сдвиг в структуре митохондрий, способный привести к нарушению функциональной активности ее мембран. На 1-е сутки послеоперационного периода в контрольной группе животных отмечался рост уровня ЛФ, содержание которых составило 14,571,32. Существенной динамики содержания ПГФ и КЛ не наблюдалось. Как и в предыдущий срок исследования, содержание ПГФ было ниже, а КЛ - выше, чем у здоровых животных (р 0,04 и р 0,02 соответственно). Содержание ХС, по сравнению с предыдущим сроком исследования, несколько повысилось, однако по-прежнему было практически в 2 раза ниже нормы - 6,330,52(р 10,0001). Статистически достоверно, по сравнению с предыдущим сроком исследований, до 19,660,71 (р 0,008) увеличилось количество ОФЛ. Как и в предыдущий срок исследований, отношение ОФЛ/ХС было достоверно выше, чем в группе здоровых животных (р 0,0009). На 3-и сутки после операции процентное содержание ПГФ было ниже (16,261,48), а КЛ не отличалось от здоровых животных и составило 10,130,97, при этом количество ЛФ оставалось достоверно повышенным - 13,941,16 (р 0,0003) по сравнению с интактными животными. Содержание ОФЛ и ХС и их соотношение не претерпевало достоверных изменений по сравнению с предыдущими сроками исследований, их отличия от здоровых животных носили аналогичный характер. Отсутствие характерного для предыдущих сроков исследований увеличения КЛ и сохранение изменений, характерных для ранних сроков исследования, позволяют предположить наличие истощения системы адаптации к патологическому воздействию. Исследование фосфолипидного спектра митохондрий на 5-е сутки послеоперационного периода подтвердило данное предположение, поскольку отмечалось достоверное, по сравнению со здоровыми животными (р 0,002), снижение содержания КЛ до 9,520,62. Содержание лизофосфатидов было по-прежнему высоким - 13,840,39 (р 0,0001). Уровень ХС составил 8,510,1 (р 0,0001), ОФЛ и ОФЛ/ХС - 23,500,64 (р 0,0003) и 2,760,11 (р 0,0001) соответственно. Оценка действия препарата Омегавен продемонстрировала его способность защищать фосфолипидный спектр митохондрий печени от негативных воздействий генерализованного воспаления при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. 3 18379 1 2014.06.30 Уже на 1-е сутки после операционного вмешательства содержание ЛФ было достоверно ниже - 11,191,08 (р 0,0001), а ПГФ - выше - 19,252,68 (р 0,017), чем у животных контрольной группы. Уровень ХС снизился по отношению к норме (р 0,0001), но достоверно превышал значение в контрольной группе (р 0,0001) - 8,230,31. Количество ОФЛ не отличалось от значений интактных животных и составило 26,871,32, достоверно превышая содержание в контрольной группе (р 0,0001). Отношение ОФЛ/ХС было достоверно выше, чем у здоровых животных - 3,260,07 (р 0,0001), и не отличалось от показателя контрольной группы. Отмечался достоверный, по сравнению с нормой, рост количества белка - 5,940,17 (р 0,0003). На 3-и сутки послеоперационного периода в основной группе отсутствовала негативная динамика увеличения уровня ЛФ. На фоне достоверного, по сравнению с контрольной группой, роста содержания ПГФ до 18,572,28 наблюдалось существенное (на 23,5 ) увеличение содержания КЛ до 12,421,48 , что также было достоверно выше нормы(р 0,015). Отмечалось статистически значимое, по сравнению с контрольной группой,увеличение содержания ОФЛ до 27,731,07 (р 0,0001). Уровень ХС был снижен, по сравнению с интактными животными (р 0,0001), - 8,010,48, а соотношения ОФЛ/ХС было равным 3,580,15, что достоверно превышало значения нормы и контрольной группой(р 0,0001). При этом наблюдался рост количества белка, концентрация которого составила 6,40,26 и была достоверно выше нормы (р 0,0001). На 5-е сутки после операции содержание ЛФ и ПГФ в митохондриях печени животных, которые получали Омегавен, не имело достоверных отличий от показателей интактных животных и составило 10,710,66 и 18,501,20 соответственно. В то же время отмечался статистически значимый, по сравнению с нормой, рост уровня КЛ до 12,291,52 (р 0,028). Содержание ХС было ниже, чем у интактных животных (р 0,0001) и в контрольной группе (р 0,048) - 8,060,42. Однако, учитывая достоверное увеличение содержания белка (р 0,0001) и единицы измерения ХС (ХС/ гр. белка) можно предположить, что незначительное (5,3 ) снижение содержания ХС обусловлено ростом белка, а не абсолютным снижением его концентрации. Уровень ОФЛ не отличался от нормы и значительно превышал показатель контрольной группы - 28,061,66 (р 0,0004). Отношение ОФЛ/ХС было выше, чем у здоровых животных, и составило 3,480,28 (р 0,0001). На фоне препарата Омегавен отмечалось значительное увеличение количества белка, которое достоверно отличалось от нормы и достигло значения 6,580,32 (р 0,0001). Применение препарата Омегавен у животных с распространенным гнойным перитонитом на 1-е и 3-и сутки послеоперационного периода оказывало защитное действие на соотношение фосфолипидов мембран митохондрий печени, позволив предотвратить его негативные изменения, а на 5-е сутки способствовало перестройке фосфолипидного спектра, по-видимому, направленной на рост функциональной активности митохондрий. Таким образом, препарат Омегавен оказывает эффективное положительное воздействие на белково-липидные соотношения и фосфолипидный спектр митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните. Действие препарата связано со снижением процентного содержания в спектре фосфолипидов митохондрий лизофосфатидов, увеличением уровня полиглицерофосфатидов и кардиолипина, что способствует сохранению осмотической устойчивости митохондрий, препятствует разобщению окислительного фосфорилирования и гиперактивации перекисного окисления липидов. Омегавен предотвращает снижение содержания общего количества фосфолипидов в мембранах митохондрий, что совместно с ростом содержания белка также указывает на высокие протективные свойства препарата, которые позволяют сохранить функциональный потенциал митохондрий печени в условиях экспериментального распространенного гнойного перитонита. Динамика белково-липидного состава и спектра фосфолипидов мембран митохондрий печени при экспериментальном распространенном гнойном перитоните Показатель Лизофосфатиды (ЛФ) Примечание р 1 - по сравнению с нормой р 2 - по сравнению с группой 6-часовой перитонит р 3 - с группой без лечения аналогичных суток. Группа 6 часовой Контрольная С применением препарата Омегавен перитонит (5) 1-е сутки (5) 3-и сутки (5) 5-е сутки (5) 1-е сутки (5) 3-и сутки (5) 5-е сутки (5) 13,541,79 14,571,32 13,941,16 13,840,39 11,191,08 11,321,64 10,531,42 р 10,006 р 10,0001 р 10,0003 р 10,0001 р 20,002 р 30,005 р 30,0001 р 30,0001 12,311,11 13,221,30 14,352,26 13,811,29 12,42,39 12,711,63 12,882,12 21,482,45 19,642,40 22,292,27 21,712,52 22,393,15 20,522,22 20,623,00 13,871,15 13,611,49 11,371,93 12,370,86 12,082,58 12,812,3 12,631,25 18379 1 2014.06.30 Источники информации 1. Ерюхин, И.А. Перитонит и абдоминальный сепсис / И.А. Ерюхин, С.А. Шляпников,И.С. Ефимова // Инфекции в хирургии. - 2004. -2. - С. 2-8. 2. Попова. Т.С. и др. Нутритивная поддержка больных в критических состояниях. - М М-Вести, 2002. - 319 с. 3. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам. - М. Медицина, 1988. - 256 с. 4... Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.