Способ получения вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Згировская Алла Александровна Гусев Анатолий Алексеевич Ломако Юрий Васильевич Минчук Юлия Николаевна Пунтус Ирина Анатольевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2232596 1, 2004.2236254 2, 2004.2166327 2, 2001.2192887 2, 2002.47433 2, 2002. Методические указания по диагностике и профилактике репродуктивнореспираторного синдрома . Минск, 2007. - С. 20-21. ПУНТУС И.А. Ветеринарная наука производству. Научные труды. Вып. 39. - Минск, 2007. - С. 233-240.(57) Способ получения вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий инфицирование перевиваемой культуры клеток -145 вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней, инкубирование инфицированной культуры клеток, сбор вируссодержащего материала и добавление защитной среды, отличающийся тем, что используют вируссодержащий материал из аттенуированного штаммаКМИЭВ-112 с титром 5,8-6,0 ТЦД 50/см 3 и защитную среду, содержащую 2,0 мас.пептона, 5,0 мас.лактозы и 0,75 мас.желатозы, при этом вируссодержащий материал и защитную среду берут в соотношении 6040. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии. Известен способ получения вакцины против вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС), включающий инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма 1-1102 гомологичного вируса, инкубирование зараженной системы, сбор вируссодержащего материала, добавление к нему защитной среды и получение целевого продукта. Недостатком вакцины, изготовленной вышеописанным способом, является неизученность ее эффективности в отношении изолятов вируса РРСС на территории Республики Беларусь 1. 18549 1 2014.08.30 Известен способ получения вакцины против вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, характеризующийся следующей совокупностью признаков 1) инфицирование чувствительной биологической системы вируссодержащим материалом из аттенуированного штамма БД вируса РРСС 2) в качестве чувствительной биологической системы используют перевиваемую культуру клеток -145 3) для инфицирования перевиваемой культуры клеток -145 используют вируссодержащий материал из аттенуированного штамма БД вируса РРСС с титром 6,0 ТЦД 50/см 3 4) инкубирование зараженной чувствительной системы 5) сбор вируссодержащего материала 6) добавление защитной среды, в качестве которой можно использовать отдельно или в комбинации гидролизат лактальбумина (ГЛА), желатозу, сахарозу и др. 7) защитную среду добавляют к вируссодержащему материалу в соотношении 35-57 соответственно. Данный способ взят как прототип 2. Недостатком данного способа является то, что для изготовления вакцины вышеописанным способом используется аттенуированный штамм БД вируса РРСС, который по антигенным и иммунобиологическим свойствам отличается от циркулирующих штаммов вируса РРСС на территории Республики Беларусь. Задачей настоящего изобретения является разработка способа создания высокоиммуногенной и безвредной вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе штамма, выделенного на территории Республики Беларусь,обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодного для изготовления вакцины, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитых животных против циркулирующих на территории Республики Беларусь вирусов РРСС. Поставленная задача достигается тем, что разработан способ получения вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней, включающий инфицирование перевиваемой культуры клеток -145 вируссодержащим материалом из штамма аттенуированного вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, инкубирование инфицированной культуры клеток, сбор вируссодержащего материала и добавление защитной среды, причем используют в качестве вируссодержащего материала аттенуированный штаммКМИЭВ-112 с титром 5,8-6,0 ТЦД 50/см 3 и защитную среду, содержащую 2,0 мас.пептона, 5,0 мас.лактозы и 0,75 мас.желатозы, при этом вируссодержащий материал и защитную среду берут в соотношении 6040. Таким образом, поставленная задача по разработке способа создания высокоиммуногенной и безвредной вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней достигается за счет использования при изготовлении вакцины для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней штамма КМИЭВ-112 штамма-антигена, выделенного на территории Республики Беларусь и обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью. Штамм КМИЭВ-112 - штамм-антиген - депонирован 26 июня 2009 г. и хранится в музее культур микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского. Штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней РКМИЭВ-112 - штамм-антиген - обладает следующими свойствами. Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству , роду 18549 1 2014.08.30 Культурально-морфологические признаки. Вирус РРСС штамма КМИЭВ-112 успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах (АМФ) поросят и перевиваемой культуре клеток -145 (клон, полученный из культуры клеток МА-104 почки эмбриона макаки-резус). Морфологические признаки. Это РНК-содержащий вирус. Геном состоит из одной молекулы линейной позитивной одноцепочечной РНК размером около 15000 нуклеотидов. Форма вириона шарообразная, размер вириона 45-75 нм с ядром, занимающим 3/4 вириона диаметром 25-35 нм, окружен липидной оболочкой. Физико-биохимические свойства. Не устойчив к эфиру, хлороформу и детергентам. Чувствителен к формальдегиду, ультрафиолетовому облучению, гамма-облучению, высыханию и к изменениюсреды. Оптимумот 5 до 7. При низких температурах (-70 С) и в лиофилизированном состоянии сохраняется до 2 лет, при 4 С - 1 месяц, при 37 С 2 суток. При температуре 55 С он инактивируется в течение 45 мин. Молекулярно-биологические признаки. Штамм КМИЭВ-112 является РНКгеномным вирусом. 5-конец РНК кэпирован, а 3-конец полиаденилирован. Ген капсидного белка расположен на 3-концевой части генома. Геном штамма КМИЭВ-112, как и все другие штаммы и изоляты вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержит восемь открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют гены репликаз(ОРС 1 а и 1 в), оболочечные белки (ОРС 2-6) и нуклеокапсидный белок (ОРС 7). Определены 6 структурных белков вируса РРСС и их соответствующих генов. Маркерные признаки. Идентификацию вируса РРСС проводили методом ПЦР в реальном времени. Онкогенность. Штамм вируса КМИЭВ-12 не является онкогенным. Данные о контаминации. Штамм вируса КМИЭВ-12 не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой, а также другими вирусами. Антигенная активность. Через 21 сутки после вакцинации поросят в сыворотках крови выявляются антитела к вирусу РРСС в пределах 2,1-5,3. Безвредность. Штамм вируса КМИЭВ-112 не реактогенен для свиней. Вирулентность. Штамм вируса КМИЭВ-112 является слабовирулентным для свиней. Биологическая активность. Титр вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней КМИЭВ-112 составляет 5,8-6,0 ТЦД 50/см 3. Иммуногенность. Штамм вируса КМИЭВ-112 является иммуногенным, поскольку через 21 сутки после иммунизации вызывает образование специфических антител у 100 свиней. Чувствительность к антибиотикам. Вирус резистентен к действию антибиотиков. Способы и условия хранения. Условия хранения лиофильно высушенный - при температуре не выше минус 20 С в течение 5 лет. Жизнеспособность его поддерживается путем пассирования на культуре клеток -145. Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде или при температуре не выше минус 20 С. В предлагаемой вакцине для стабилизации вакцины при лиофильной сушке используют защитную среду, состоящую из пептона, лактозы и желатозы. Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами. Пример 1. Выделение штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней РКМИЭВ-112. Вирус РРСС штамма КМИЭВ-112 успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах (АМФ) поросят. Для получения АМФ использовали 4-6-недельных поросят, свободных от патогенной микрофлоры ферм. АМФ выделяли 2-кратным промыванием отпрепарированных и изолированных легких забуференным физраствором,содержащим антибиотики (пенициллин, стрептомицин, неомицин и амфотерицин), кото 3 18549 1 2014.08.30 рый нагнетали через трахею с помощью автоматического шприца с иглой (около 500 мл). Выбор жидкости из легких, содержащей АМФ, проводят обычно шприцами через то же отверстие. Суспензию клеток из легких центрифугировали при 1500 оборотах 15 мин. При наличии эритроцитов к осадку добавляли 0,83 -ный раствор хлорида аммония и после 5-минутной инкубации при комнатной температуре клетки вновь центрифугировали при тех же условиях. Заражение вирусом РРСС проводили через 2-24 ч после 2-кратной отмывки питательной средой и антибиотиками. Учет цитопатического действия вируса проводили через 24, 48, 72, 96 и 120 ч. Тот факт, что выделенный вирус относится к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома европейского генотипа, подтвержден в полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием тест-системы для обнаружения вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней согласно методическим указаниям по выявлению РНКвируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени с использованием Тестсистемы для обнаружения репродуктивного и респираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции в реальном времени производства ЗАО НПО НАРВАК,(Россия) Утв. ГУВ 1 октября 2008 года 3. Пример 2. Получение вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней из штамма КМИЭВ-112. Вакцину живую против РРСС готовят из матрового вируса штамма КМИЭВ-112,выращенного в перевиваемой культуре клеток -145 3-суточного возраста с концентрацией 125000 клеток/мл. Матровый вирус считается пригодным для накопления вирусного сырья с титром не менее 5,8-6,0 ТЦД 50. Вирус выращивают в матрасах емкостью 1,5 дм 3 с полностью сформированным монослоем. Из матрасов удаляют среду роста, отмывают клеточный монослой дважды раствором Хенкса от продуктов метаболизма. На монослой наносят вирус матровой серии в дозе 0,1-0,2 ТЦД 50 на клетку, адсорбцию вируса проводят при 37 С в течение 60 мин. После чего в матрасы вносят среду Игла на растворе Хенкса в объеме 150-200 мл с обогащением фетальной сывороткой в концентрации 2 с добавлением антибиотиков (смесь пенициллина и стрептомицина из расчета 100 мкг/мл). В качестве контроля оставляют 2 незараженных матраса, в которых среду роста заменяют поддерживающей средой. Размножение вируса в культуре клеток -145 определяют по характерному цитопатическому действию (ЦПД) с образованием скопления шарообразных клеток, поднимающихся над монослоем и в конечной стадии деструкции клеток. В контрольных матрасах не должно наблюдаться никаких деструктивных изменений клеток. Матрасы, в которых через 96-120 ч наблюдаются цитопатические изменения монослоя, отбирают и замораживают при -80 С. Вирус для изготовления вакцины получают 2-кратным замораживанием и оттаиванием инфицированных клеток с последующим объединением содержимого всех матрасов в одну емкость. Полученный вирус освобождают от клеточного детрита центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин. Очищенная от детрита суспензия имеет вид прозрачной жидкости розовато-вишневой цвета. Полученный вирус контролируют на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры и на инфекционную активность. Производственная серия вируса РРСС штамма КМИЭВ-112 считается пригодной для изготовления вакцин, если инфекционный титр составляет не менее 5,8-6,0 ТЦД 50 и отсутствует грибковая и бактериальная контаминация. 4 18549 1 2014.08.30 Очищенную вируссодержащую суспензию соединяют с защитной средой, состоящей из пептона, лактозы и желатозы, в соотношении 6040 и выдерживали при 4 С в течение 12 ч для стабилизации. Пептона, лактозы и желатозы должно содержаться в конечной концентрации 2, 5 и 0,75 мас.соответственно. Полученную вакцину фасовали в стеклянные флаконы и лиофилизировали на установке для лиофильного высушивания с программным обеспечением фирмы(Германия) в течение 48 ч. После окончания сушки флаконы под вакуумом плотно укупоривали пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками. Лиофилизированную вакцину контролировали в соответствии с техническими условиями на стерильность, безвредность и иммуногенность. Пример 3. Проверка стерильности вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней из штамма КМИЭВ-112. Для проверки стерильности полученной лиофилизированной вакцины против РРСС содержимое 3-х флаконов растворяют дистиллированной водой в объеме, равном объему вакцины до высушивания, соблюдая стерильность, и объединяли в общую пробу. Затем делали высевы по 0,3 см 3 в пробирки с мясо-пептонным агаром (МПА) и со средой Сабуро и по 0,5 см 3 в пробирки с мясо-пептонным печеночным бульоном (МППБ) под вазелиновым маслом, используя по 2 пробирки каждой из указанных питательных сред. Питательные среды с посевами выдерживали в термостате в течение 10 дней при 37 С, а среду Сабуро - при 20 С. Через 10 дней пробирки с посевами проверяли визуально на наличие роста микроорганизмов. В питательных средах с посевами роста бактериальной и грибковой микрофлоры не отмечено. Пример 4. Определение безвредности вакцины против РРСС из штамма КМИЭВ-112. Безвредность вакцины проверяли на 10 белых мышах и 6 поросятах в возрасте 2128 суток. Три флакона с вакциной растворяли физиологическим раствором до объема,указанного на этикетке, объединяли в общую пробу, готовили 10-кратную иммунизирующую дозу, которая составляли 104,0 ТЦД 50/см 3. Мышей (особей) иммунизировали подкожно в объеме 0,5 мл. Четырем поросятам, не содержащим антител к вирусу репродуктивнореспираторного синдрома свиней, вводили внутримышечно 10-кратную иммунизирующую дозу вакцины в объеме 2 мл. Остальные 4 мыши и два поросенка служили контролем, им вводили физиологический раствор (плацебо) в том же объеме, что и предыдущим мышам и поросятам. За животными наблюдали в течение 14 суток. Вакцина не вызывала у вакцинированных мышей и поросят в течение 14 суток клинических признаков заболевания и видимых изменений тканей на месте введения вакцины. Пример 5. Определение иммуногенной активности вакцины против РРСС из штамма КМИЭВ 112. Иммуногенную активность вакцины из штамма КМИЭВ-112 проверяли на 6 поросятах 21-28-дневного возраста, не имеющих в сыворотке крови антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Четырем поросятам вводили внутримышечно вирус в объеме 2 см 3 (доза вируса составляла 4,0 ТЦД 50 вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней), два поросенка служили контролем, им вводили внутримышечно физиологический раствор. Через 21 сутки после иммунизации у всех животных отбирали кровь с целью получения сыворотки для определения наличия антител к вирусу РРСС методом твердофазного иммуносорбентного ферментного анализа. Для определения наличия в сыворотках крови антител к вирусу РРСС использовали набор 2.0 производства(Корея). 5 18549 1 2014.08.30 Пробу сыворотки крови оценивали как положительную, если соотношение / (отношение проба/положительный контроль) было больше или равно 0,4. Пробу сыворотки крови оценивали как отрицательную, если соотношение / было меньше 0,4. Результаты изучения иммуногенной активности вакцины против РРСС штамма КМИЭВ-112 представлены в таблице. Результаты изучения иммуногенной активность вакцины из штамма КМИЭВ-112 Уровень антител в ИФА, /поросенка До иммунизации Через 14 суток Через 21 сутки 1 0,01 1,9 2,1 2 0,02 2,6 3,1 3 0,01 3,9 5,3 4 0,01 2,5 3,7 5 (контроль) 0,03 0,03 0,03 6 (контроль) 0,01 0,01 0,01 Как видно из таблицы, иммунизация экспериментальных поросят вакциной против РРСС из штамма КМИЭВ-112 приводила к образованию антител в сыворотках крови на 21 сутки после вакцинации (показатель / составлял 2,1-5,3). Таким образом, заявляемый способ позволяет изготовить вакцину для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней на основе аттенуированного штаммаКМИЭВ-112, выделенного на территории Республики Беларусь и являющегося эндемичным для данной территории, отличающегося по антигенным и иммунобиологическим свойствам от штамма, использованного в прототипе. Вакцина является стерильным, безвредным препаратом и обладает высокими иммуногенными свойствами. Введение вакцины животным приводит к формированию напряженного иммунитета. Источники информации 1. РСТ 92/21375, МПК 61 39/12,01 33/569,12 7/00, 1992. 2.2232596 1, МПК 61 39/12,12 7/00 // ( 12 7/00,12 193), 2004(прототип). 3. Инструкция по применению Тест-системы для обнаружения вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (организация-производитель - ООО Ветбиофарм, Москва), утверждена Россельхознадзором 21 мая 2009. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6