Применение ишемического посткондиционирования для улучшения кислородтранспортной функции крови при ишемии-реперфузии печени

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ПОСТКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ КИСЛОРОДТРАНСПОРТНОЙ ФУНКЦИИ КРОВИ ПРИ ИШЕМИИ-РЕПЕРФУЗИИ ПЕЧЕНИ(71) Заявитель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(72) Авторы Ходосовский Михаил Николаевич Зинчук Виктор Владимирович(73) Патентообладатель Учреждение образования Гродненский государственный медицинский университет(56)2394574 1, 2010. ХОДОСОВСКИЙ М.Н. и др. Актуальные вопросы гепатологии. 5-й международный симпозиум гепатологов Беларуси. - Гродно, 2002. - С. 32-33. ЗИНЧУК В.В. и др. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2002. -4. - С. 8-11. ХОДОСОВСКИЙ М.Н. Медицина на рубеже веков. Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 40-летию ЦНИЛ БГМУ, в 2-х частях. Ч. 2. - Минск, 2003. - С. 405-409.. - 2000. . 232. - . 2. - . 155-162.... . - 2010. - . 16, . 15. - . 1871-1878... . . 2002. - . 33. - . 9. - . 1200-1208.... . 2010. - . 16, . 48. - . 6058-6067.(57) Применение ишемического прекондиционирования для улучшения кислородтранспортной функции крови при ишемии-реперфузии печени. Изобретение относится к области медицины, а именно к применению известных способов по новому назначению. Синдром ишемии-реперфузии печени часто встречается в клинической практике при резекциях, трансплантации органа и после шоковых состояний 1, 2. В развитии данного синдрома важную роль играют нарушения кислородтранспортной функции (КТФ) крови 3, 4. Ишемия и последующая реперфузия печени сопровождаются снижением сродства гемоглобина к кислороду (СГК), метаболическим ацидозом, а также снижением 2 крови,оттекающей от печени 3. Данные нарушения приводят к активации свободнорадикальных процессов, развитию окислительных повреждений органа и способствуют его функциональной недостаточности в постишемическом периоде 3, 4. Вместе с тем известно,18417 1 2014.08.30 что коррекция КТФ крови может влиять на степень окислительных повреждений органов при ишемии-реперфузии 4, 5. Известны способы коррекции КТФ крови при ишемии-реперфузии мозга и печени с помощью модификации СГК препаратом 13 и нитропруссидом натрия 5, 6. Так, способ направленного снижения СГК с помощью 13 способствует уменьшению развивающихся повреждений нейронов при неполной ишемии головного мозга 5. Недостатком данного способа является то, что при более глубокой, глобальной ишемии этот защитный эффект отсутствует, возможно, в связи с изменением соотношения доноров и акцепторов электронов при ишемических состояниях различной степени тяжести. Другой способ, основанный на применении нитропруссида натрия в качестве средства, увеличивающего СГК при ишемии-реперфузии печени, действительно способствует уменьшению нарушений прооксидантно-антиоксидантного и функционального состояния органа при данной патологии 6, 7. К недостаткам этого способа следует отнести его слабое влияние на параметры кислотно-основного состояния крови после ишемии, а также необходимость постоянного контроля артериального давления, так как нитропруссид натрия обладает мощным гипотензивным действием. Задача изобретения - расширение арсенала способов, улучшающих КТФ крови при ишемии-реперфузии печени. Поставленная задача решается применением ишемического прекондиционирования для улучшения кислородтранспортной функции крови при ишемии-реперфузии печени. Известно применение ишемического прекондиционирования (ИП) для повышения устойчивости печени к продолжительным периодам ишемии и последующей реперфузии 1, 2. Показано, что ИП способствует уменьшению воспалительной реакции и генерации активных форм кислорода, снижению активности проапоптотических ферментов (каспаз),улучшению функции митохондрий, снижению активности трансаминаз крови 1, 2, 8, 9. Все эти данные свидетельствуют о том, что ИП оказывает определенный протективный эффект на печень при ишемии-реперфузии. Однако из известного не вытекает с очевидностью, что ИП можно применять для коррекции КТО крови при ишемии-реперфузии печени. Способ осуществляют следующим образом. Перед началом основного периода ишемии осуществляют ишемическое прекондиционирование путем наложения сосудистого зажима на печеночно-двенадцатиперстную связку, короткий 10-минутный период ишемии с последующим 10-минутным интервалом реперфузии, после чего выполняют ишемиюреперфузию печени. Способ воспроизведения ишемии печени путем наложения сосудистого зажима на печеночно-двенадцатиперстную связку (маневр Прингла) широко используется в клинике и при моделировании ишемии-реперфузии печени у экспериментальных животных 1, 2, 10. Продолжительность периодов прекондиционирования (10 мин ишемии/10 мин реперфузии) обусловлена данными о наибольшем протективном эффекте такого сочетания на печень при ишемии-реперфузии 10. Для доказательства возможности использования изобретения исследовали влияние ИП на КТО крови при ишемии-реперфузии печени у кроликов. Ишемию печени в течение 30 мин вызывали наложением сосудистого зажима на печеночно-двенадцатиперстную связку ( ). Исследовали показатели КТФ (СГК, 2, 2, ,и др.) печеночной и смешанной венозной крови на протяжении ишемии-реперфузии печени. Установлено, что реперфузия печени сопровождается развитием глубокого смешанного ацидоза с выраженным метаболическим компонентом, снижением рО 2 крови, оттекающей от печени, гиперкапнией и сдвигом КДО вправо. Применение ИП при ишемии-реперфузии печени у кроликов способствует улучшению кислотно-основного состояния и устранению гиперкапнии и гипоксемии в обоих образцах венозной крови, сдвигу КДО влево. 2 18417 1 2014.08.30 Работа выполнена на взрослых кроликах-самцах весом 3,5-4,5 кг, предварительно выдержанных в стандартных условиях. Под комбинированным внутривенным наркозом(гексенал 30 мг/кг калипсол 1,5 мг/кг/мин) вводили катетеры один - в . для забора печеночной венозной крови, а другой - в правое предсердие для получения смешанной венозной крови. Ишемию печени в течение 30 мин вызывали маневром Прингла - наложением сосудистого зажима на печеночно-двенадцатиперстную связку ( ) 1. После снятия зажима реперфузионный период длился 120 мин. Забор образцов крови для оценки КТФ осуществляли до и в конце ишемии, а также на 120 мин реперфузионного периода. Животных разделили на две группы в 1-й группе (10) моделировали ишемиюреперфузию печени, а во 2-й группе (7) перед началом основного 30-минутного периода ишемии таким же способом выполняли короткий 10-минутный период ишемии с 10-минутным интервалом последующей реперфузии 10, затем моделировали ишемиюреперфузию печени, как в 1-й группе. На микрогазоанализаторе -15 (США) оценивали показатели КТФ крови 50 реальн, 2, 2, , бикарбонат плазмы (3-), общий 2 плазмы (2), действительный избыток оснований . СГК определяли по показателю 50 (2 крови, соответствующее 50 насыщению ее кислородом). 50 станд рассчитывали для стандартных условий(7,4 240 мм рт. ст. и 37 С). На основании полученных значений 50 по уравнению Хилла высчитывали положение кривой диссоциации оксигемоглобина (КДО). Все полученные результаты обработаны методом вариационной статистики с использованием -критерия Стьюдента или -теста в зависимости от нормальности распределения выборок. Достоверными считали различия при 0,05. В 1-й группе ишемия печени приводила к уменьшению 2 на 46,3(0,001) по отношению к исходному уровню в крови, оттекающей от печени. Одновременно наблюдалось уменьшение показателей , 3-, 2, , ,и увеличение показателя 2 на 41,3(0,05) в оттекающей от печени крови, отражая развитие смешанного ацидоза, с выраженным метаболическим компонентом. В смешанной венозной крови на 30-й минуте ишемии у животных 1-й группы показатель 2 не изменялся, хотя другие параметры кислотно-основного состояния проявляли схожую динамику изменений, как в печеночной венозной крови. В конце ишемического периода у кроликов 1-й экспериментальной группы наблюдалось увеличение 50 реальн на 14,8 (0,05) и 20,1(0,05) в печеночной и смешанной венозной крови, соответственно свидетельствуя о сдвиге КДО вправо. В конце реперфузионного периода у животных 1-й группы 2 печеночной венозной крови оставалось меньше исходного на 33,6(0,05), усугублялись нарушения кислотноосновного состояния. Так, на 120-й минуте реперфузии более выражено снижались ,3-, 2, , ,и сохранялся повышенным показатель 2 в оттекающей от печени крови. В смешанной венозной крови те же показатели кислотно-основного состояния продолжали снижаться, тогда как 2 не отличался от исходных значений. В конце реперфузионного периода наблюдалось дальнейшее увеличение показателя 50 реальн,который был выше исходных в печеночной и смешанной венозной крови на 23,1(0,001) и 33,1(0,001) соответственно. Применение ИП у животных 2-й группы приводило к снижению в образцах исходной крови показателя 2, а также связанных с последним параметром кислотно-основного состояния 3- и 2 в смешанной венозной крови. Как и в 1-й группе, у кроликов 2-й группы в конце ишемии наблюдалось уменьшение показателей , , ,и увеличение показателя 2 в обоих образцах исследуемой крови. На 30-й минуте ишемии в печеночной венозной крови снижался показатель 2 по отношению к исходному на 37,7(0,05), а рСО 2 увеличивался на 88,6(0,01). В смешанной венозной кро 3 18417 1 2014.08.30 ви в этот период показатель 2 по отношению к исходному не изменялся, а 2 увеличивался на 25,6(0,05). Следует отметить, что у животных 2-й группы в конце ишемии показатели 3- и 2 в печеночной венозной крови по отношению к исходным уровням не изменялись, тогда как в смешанной венозной крови были ниже на 23,0(0,01) и 21,1(0,01) соответственно. В конце ишемического периода у кроликов 2-й экспериментальной группы наблюдалось увеличение р 50 реальн на 23,4 (0,05) и 28,0(0,01) в печеночной и смешанной венозной крови соответственно. Таблица 1 Показатели кислородтранспортной функции печеночной венозной крови у экспериментальных животных Ишемия-реперфузия печени(2-я группа,7) 120 мин 30 мин Исходная реперфуишемии зии 30,90,9 38,12,5 33,50,8 32,50,9 27,92,7 31,60,7 103,07,9 112,09,0 104,67,9 40,12,8 25,05,6 42,03,9 7,4367,1177,3530,0310,0530,050 40,21,9 75,89,1 41,72,4 27,41,2 24,41,3 23,51,5 28,61,2 26,81,3 24,81,6 3,61,5 -5,31,9 -1,31,7 3,01,6 -4,52,2 -2,21,9 27,11,2 19,21,6 23,21,3 Примечание- достоверное отличие от исходного уровня в соответствующей группе(0,05)- достоверное отличие от животных 1-й группы в соответствующий период времени (р 0,05). На 120-й минуте реперфузии у животных 2-й группы наблюдалось улучшение параметров КТО крови. Так, в конце реперфузии показатели 2, 2, 3- и 2 не отличались от исходных в обоих образцах венозной крови. Показательна 120-й минуте реперфузии в смешанной венозной крови оставался ниже исходного уровня, тогда как в печеночной венозной крови данный показатель улучшался, не отличаясь от доишемических значений. В обоих образцах показательбыл выше, чем у кроликов 1-й группы в конце реперфузии. Следует отметить улучшение показателя 2 в печеночной венозной крови в конце реперфузионного периода, который был существенно выше, чем у животных 1-й группы. Показатели ,ина 120-й минуте реперфузии в обоих образцах венозной крови были ниже исходных значений. Так, показательв печеночной и смешанной венозной крови в конце реперфузии был ниже исходных значений на 14,2(0,05) и 13,1(0,05) соответственно. Однако показательпеченочной венозной крови в данный период был выше, чем у животных 1-й группы. В конце реперфузионного периода у кроликов 2-й группы в печеночной и смешанной венозной крови увеличение показателя р 50 реальн по отношению к исходным составило только 8,5 (0,05) и 13,1(0,05) соответственно. Данный сдвиг КДО вправо у животных с ИП был меньшим, чем у кроликов 1-й группы в конце реперфузии. 4 18417 1 2014.08.30 Таблица 2 Показатели кислородтранспортной функции смешанной венозной крови у экспериментальных животных Показатель(1-я группа,10) печени 30 мин 120 мин реИсходная перфузии ишемии Прекондиционированиеишемияреперфузия печени (2-я группа,7) 30 мин ише- 120 мин реИсходная мии перфузии Примечание- достоверное отличие от исходного уровня в соответствующей группе(0,05)- достоверное отличие от животных 1-й группы в соответствующий период времени (0,05). На фигуре показано положение КДО смешанной венозной крови у кроликов на 120-й минуте реперфузии. Полученные данные свидетельствуют, что моделирование ишемии-реперфузии печени с помощью маневра Прингла приводило к глубоким нарушениям кислотно-основного состояния у кроликов 1-й экспериментальной группы. Развитие метаболического компонента смешанного ацидоза (судя по снижению показателей , 3-, 2, ,и) в реперфузионном периоде здесь сопровождалось отсутствием восстановления 2 печеночной венозной крови. Последнее могло быть следствием микроциркуляторных расстройств в печени из-за преобладания вазоконстрикторов над вазодилататорами после тяжелой ишемии 8. Высокие значения показателя 2 после ишемии и в реперфузионном периоде у животных 1-й экспериментальной группы указывают на наличие респираторного компонента ацидоза. Данные изменения могли быть следствием реперфузионного повреждения легких, что часто наблюдается при ишемии-реперфузии печени 9. Суммарно снижениеи повышение 2 существенно изменили СГК крови в сторону уменьшения (судя по показателям 50 реальн) в реперфузионном периоде. Данные изменения СГК,по-видимому, способствуют увеличению отдачи кислорода в ткани печени после ишемии,что может быть фактором усиления дисбаланса между донорами и акцепторами электро 5 18417 1 2014.08.30 нов в дыхательной цепи и активации свободнорадикальных процессов перекисного окисления липидов, т.е. кислородного парадокса 4, 9. Применение ИП улучшало показатели КТФ крови у животных 2-й группы, что было особенно выражено в конце реперфузионного периода. Так, показатель 2 печеночной венозной крови на 120-й минуте реперфузии был существенно выше, чем у животных 1-й группы в соответствующий период. Кроме того, данный показатель не отличался от его исходных значений во 2-й группе, что могло быть следствием улучшения процессов микроциркуляции в печени в реперфузионном периоде под влиянием ИП 8. Несмотря на небольшой рост показателя 2 в смешанной венозной крови в конце ишемии, его значения оставались в пределах физиологической нормы, указывая на удовлетворительную функцию легких у кроликов 2-й группы. Более того, в конце реперфузионного периода этот показатель не отличался от исходных значений в обоих образцах исследуемой крови и был ниже, чем у животных 1-й группы и кроликов, получавших нитропруссид натрия 6. В конце реперфузионного периода у кроликов с ИП улучшались показатели , , печеночной венозной крови, свидетельствуя об улучшении метаболизма в печени по сравнению с животными 1-й группы, а также с кроликами, получавшими нитропруссид натрия при ишемии-реперфузии печени 6. На 120-й минуте реперфузии у кроликов 2-й группы КДО смещалась влево по сравнению с ее положением у животных 1-й группы,что было подобно тому, как СГК изменялось у экспериментальных животных при использовании нитропруссида натрия 6. Данные изменения СГК в крови у животных с ИП могли благотворно сказаться на условиях доставки кислорода тканям в реперфузионном периоде, улучшая его утилизацию и редокс-состояние митохондрий 4, 11. Сдвиг КДО влево в данных условиях возможно является положительным фактором для тканей, поскольку последние не могут полноценно утилизировать 2 в постишемическом периоде, из-за чего усиливаются процессы радикалообразования и реперфузионные повреждения 4, 12. Учитывая то, что ИП увеличивает долю артериального кровотока в печени после ишемии, повышение СГК данной крови имеет еще большее значение для баланса доноров и акцепторов электронов в дыхательной цепи митохондрий 1, 11. Установлено, что применение ИП улучшает функцию митохондрий и их биоэнергетику при ишемии-реперфузии печени 11, 12. Вторичными мессенджерами данного эффекта считают аденозин, оксида азота, индуцированный гипоксией фактор-1 и др. 12. Примечательно, что индуцированный гипоксией фактор-1 под влиянием аденозина способствует экспрессии в гепатоцитах трансмембранной карбоангидразы, которая участвует в компенсации ацидоза, вызванного ишемией 12. Показано, что ИП приводит к активации в печени индуцибельной синтазы оксида азота 13. Взаимодействие гемоглобина с оксидом азота может вести к образованию -нитрозогемоглобина, что увеличивает СГК крови 14. Данный механизм изменения СГК мог играть определенную роль у животных 2-й группы в конце реперфузионного периода. В целом, реперфузия печени сопровождается развитием глубокого смешанного ацидоза с выраженным метаболическим компонентом, отсутствием восстановления 2 крови,оттекающей от печени, гиперкапнией и сдвигом КДО вправо. Применение ИП при ишемии-реперфузии печени у кроликов способствует улучшению кислотно-основного состояния и устранению гиперкапнии и гипоксемии в обоих образцах венозной крови,сдвигу КДО влево. Таким образом, ИП действительно улучшает кислородтранспортную функцию крови при ишемии-реперфузиии печени. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7