Вакцина инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней и способ ее получения

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ПРОТИВ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гусев Анатолий Алексеевич Ястребов Аскалон Сергеевич Згировская Алла Александровна Финогенов Артем Юрьевич Лемиш Артем Петрович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского Национальной академии наук Беларуси(56) САВЕЛЬЕВА Т.А. и др. Ветеринарная наука - производству. Научные труды. Вып. 37. - Минск, 2005. - С. 130-136. ЯСТРЕБОВ А.С. Научно-практическая конференция Совершенствование технологии производства свинины на комплексах и фермах промышленного типа Минской области. - Минск, 2003. С. 125-128. НОВИКОВ О.Г. и др. Актуальные проблемы патологии сельскохозяйственных животных. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня образования БелНИИЭВ им. С.Н.Вышелесского. - Минск, 2000. - С. 164. ПУНТУС И.А. Ветеринарная наука производству. Научные труды. Вып. 39. Минск, 2007. - С. 233-240.2236254 2, 2004.2232596 1, 2004.(57) 1. Вакцина инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, отличающаяся тем, что содержит культуральную жидкость сКМИЭВ-35, инактивированным теотропином в концентрации 0,4-0,5 , и адъювант 52, взятые в количестве 40-50 и 60-50 об.соответственно,причемКМИЭВ-35 выращен до титра 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3 в культуре клеток -145 на питательной среде Игла, содержащей 2-3 сыворотки крови крупного рогатого скота. 2. Способ получения вакцины инактивированной против репродуктивно-респираторного синдрома свиней по п. 1, заключающийся в том, чтоКМИЭВ-35 вносят в заражающей дозе 0,3-0,4 ТЦД 50 на клетку в культуру клеток -145, выращиваемых при температуре 37-38 С на среде Игла с 23 сыворотки крови крупного рогатого скота, выращивают в течение 5-7 суток до титра 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3, культуральную жидкость, содержащую вирус, отделяют, двукратно замораживают при температуре 26 С и оттаивают при температуре 37 С, вирус инактивируют в течение 12-24 часов при температуре 37 С тетропином, который вносят в куль 16858 1 2013.02.28 туральную жидкость до концентрации 0,4-0,5 , и затем смешивают культуральную жидкость, содержащую инактивированный вирус, с адъювантом 52 в количестве 40-50 и 60-50 об.соответственно. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано для профилактики репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Известна вакцина против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая в своем составе аттенуированный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней с титром 104,5 ТЦД 50/мл, выращенная на культуре клеток -145 1. Известна также вакцина сухая культуральная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней, содержащая аттенуированный штамм вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней с титром не менее 106,0-6,5 ТЦД 50/мл, выращенная на культуре клеток -145 2. Этим вакцинам присущ недостаток, заключающийся в том, что при их применении возможна длительная персистенция вакцинного вируса в организме свиней, передача его от вакцинированных животных невакцинированным, прохождение вируса через плаценту и инфицирование плодов. Кроме того, возможна вероятность обострения латентных инфекций у животных-вирусоносителей и отрицательного влияния на репродуктивную функцию у свиноматок. Этот недостаток устранен в вакцине инактивированной против репродуктивнореспираторного синдрома свиней с титром 106,0-6,3 ТЦД 50/мл, выращенной первоначально на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней, а затем на перевиваемой культуре клеток тестикул свиней. Для производства вакцины использован штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, выделенный в Испании 3. Эта инактивированная вакцина имеет недостаток, заключающийся в том, что для ее изготовления используется первичная культура клеток альвеолярных макрофагов свиней и первичная культура клеток тестикул свиней, что связано с тем, что для получения культуры клеток альвеолярных макрофагов свиней требуются клинически здоровые поросята в возрасте 6-8 недель, свободные от антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней и к возбудителям других инфекционных заболеваний (классической чумы свиней, болезни Ауески, парвовирусной болезни свиней), что является дорогостоящей и трудоемкой операцией. Перевиваемая культура клеток тестикул свиней в Республике Беларусь не производится. Этот недостаток устранен в вакцине инактивированной против репродуктивнореспираторного синдрома свиней (РРСС), содержащей активное вещество в виде суспензии авирулентного и очищенного анигенного материала из штамма КПР-96 вируса РРСС, семейства , рода , полученного в культуре клеток -145 с инфекционной активностью не менее 5,0 ТЦД 50/мл в количестве 33,0 мас. , и целевой добавки - масляного адъюванта марки-70 в количестве 67,0 мас.4. Эта вакцина обладает недостатком, который заключается в том, что вакцина содержит штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней европейского генотипа,который имеет различия в нуклеотидной и аминокислотной последовательности по сравнению с вирусами репродуктивно-респираторного синдрома, выделенным в Республике Беларусь, что может привести к снижению эффективности вакцины. Известные способы получения заявляемой вакцины не позволяют ее получить ввиду того, что в известных способах используются дорогостоящие компоненты, которые не производятся в Республике Беларусь. Известен способ получения инактивированной вакцины против репродуктивнореспираторного синдрома свиней, включающий выращивание вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней сначала на первичной культуре клеток альвеолярных 2 16858 1 2013.02.28 макрофагов, а затем - на перевиваемой культуре клеток тестикул свиней с титром 106,0-6,3 ТЦД 50/мл, заражение клеток вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней одновременно со сменой ростовой среды на поддерживающую, культивирование вируса на клетках, инактивацию вируса (-пропиолактоном, внесение в культуральную жидкость, содержащую инактивированный вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, масляного адъюванта 5. Этот способ получения вакцины обладает недостатком, заключающимся в том, что получение культуры клеток альвеолярных макрофагов свиней и свиных тестикул является дорогостоящим и трудоемким. Известен способ получения инактивированной вакцины против репродуктивнореспираторного синдрома свиней, включающий получение и выращивание вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней ОБ, выделенного в России от свиноматки с патологией репродукции, на культуре клеток -145 на питательной среде с сывороткой крови крупного рогатого скота с титром 107,7-8,3 ТЦД 50/мл с последующей инактивацией вируссодержащей жидкости формалином с добавлением адъюванта 6. Этот способ обладает недостатком, который заключается в том, что штамм ОБ вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, выделенный в России, имеет антигенные различия по сравнению со штаммом, выделенным в Беларуси, что не позволяет получить эффективную вакцину для Беларуси. Задачей предлагаемого изобретения является конструирование инактивированной вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней и разработка способа ее получения с использованием штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, выделенного в Беларуси, что позволяет повысить эффективность вакцинации свиней против репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Поставленная задача достигается тем, что вакцина инактивированная против репродуктивно-респираторного синдрома свиней содержит культуральную жидкость сКМИЭВ-35, инактивированным теотропином в концентрации 0,4-0,5 , и адъювант 52, взятые в количестве 40-50 и 60-50 об.соответственно, причемКМИЭВ-35 выращен до титра 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3 в культуре клеток -145 на питательной среде Игла, содержащей 2-3 сыворотки крови крупного рогатого скота. Кроме того поставленная задача достигается тем, что в способе получения вакцины инактивированной против репродуктивно-респираторного синдрома свиней по п. 1, заключающемся в том, чтоКМИЭВ-35 вносят в заражающей дозе 0,3-0,4 ТЦД 50 на клетку в культуру клеток -145, выращиваемых при температуре 37-38 на среде Игла с 2-3 сыворотки крови крупного рогатого скота, выращивают в течение 5-7 суток до титра 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3,культуральную жидкость, содержащую вирус, отделяют, двукратно замораживают при температуре 26 и оттаивают при температуре 37 , вирус инактивируют в течение 12-24 часов при температуре 37 теотропином, который вносят в культуральную жидкость до концентрации 0,4-0,5 , и затем смешивают культуральную жидкость, содержащую инактивированный вирус, с адъювантом 52, в количестве 40-50 и 60-50 об.соответственно. Предлагаемый штаммродаКМИЭВ-35 Таксономическая принадлежность. Штамм вируса РРСС КМИЭВ-35 относится к семейству , роду , виду. Морфологические признаки штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) КМИЭВ-35. Вирионы диаметром 45-70 нм, их плавучая плотность в сахарозе составляет 1,13-1,17 г/см 3, хлористом цезии - 1,17-1,20 г/см 3. Вирус репродуциру 3 16858 1 2013.02.28 ется в цитоплазме клетки, чувствителен к хлороформу и эфиру, колебаниямниже 5,0 и выше 7,0. Снижает свою активность при 37 через 3 часа, при 20 через 20 часов, при 56 через 6 минут. Инактивируется при 56 в течение 45 минут. Биологические свойства. Штамм вируса РРСС не обладает гемагглютинирующими свойствами по отношению к эритроцитам крупного рогатого скота, кролика, кур, лошади,морской свинки, свиньи, крысы и человека. Обладает антигенными свойствами, не чувствителен к антибиотикам. Культивирование. Вирус РРСС успешно репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах свиней. Чувствительными к вирусу являются 2 клоновых варианта перевиваемой линии клеток -104 - -2621 и -145. Вирулентность. Штамм вируса РРСС КМИЭВ-35 патогенен для свиней и не патогенен для лабораторных животных (кролика, морской свинки, белой мыши). Для выделения штаммародаКМИЭВ-35 первоначально использовали первичную культуру клеток альвеолярных макрофагов свиней, а затем перевиваемую культуру клеток -145. До выделения вируса РРСС на культуре клеток осуществляют следующие подготовительные операции в качестве патологического материала для заражения культуры клеток альвеолярных макрофагов свиней (АМС) использовали сыворотку крови от слабых и нежизнеспособных новорожденных поросят и патматериал (легкие, портальные лимфоузлы,тонзилы, транссудат из грудной полости, селезенку) от больных и мертворожденных поросят. Из патматериала готовили 20 -ную суспензию, которую центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную жидкость обрабатывали антибиотиками(гентамицин из расчета 50-100 мкг/мл, амфотерицин 2,5 мг/мл), выдерживали в течение 60 минут при комнатной температуре, проверяли на стерильность на питательных средах(МПБ, МПА, МППБ, среда Сабуро) и замораживали при 26 . Для получения первичной культуры клеток альвеолярных макрофагов свиней использовали клинически здоровых поросят в возрасте 6-8 недель, не содержащих антител к вирусу РРСС, из свиноводческих хозяйств, благополучных по инфекционным болезням. Животных убивали, извлекали легкие, вымывали легочные макрофаги. Количество клеток АМС подсчитывали в камере Горяева и их концентрацию суспензии доводили до 36106 клеток/мл. Взвесь клеток вносили в пластиковые матрасы объемом 50-200 см 3, с ростовой средой, инкубировали в течение 24 часов в 2-инкубаторе с содержанием 5 углекислоты при 37 . Ростовую среду сливали, монослой клеток промывали средой Игла, вносили патологический материал (стерильную надосадочную жидкость, полученную путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 30 минут) в объеме 10 от объема поддерживающей среды. После инкубирования патматериала в течение 60 минут при 37 его сливали, монослой трижды промывали средой Игла и вносили свежую поддерживающую среду Игла с добавлением 5-10 фетальной сыворотки крупного рогатого скота, гентамицина (50 мкг/мл), амфотерицина (2,5 мкг/мл), глютамина (0,3 мг/мл). Инкубирование патологического материала на культуре клеток АМС проводили в 2 инкубаторе в течение 4-5 дней с ежедневной микроскопией монослоя клеток 7. Пример 1. Способ приготовления вакцины инактивированной против репродуктивнореспираторного синдрома свиней. Способ получения вакцины инактивированной против репродуктивно-респираторного синдрома свиней осуществляли следующим образом. Перевиваемую культуру клеток-145 выращивали в 1,5-литровых матрасах на среде Игла с добавлением к ней глютамина из расчета 0,3 мг/мл, гентамицина (50 мкг/мл), амфотерицина В (2,5 мг/мл), 1015 сыворотки крови крупного рогатого скота. Перевиваемую культуру клеток 145 выращивали в матрасах в течение 2-3 суток в термостате при температуре 37-38 до образования не менее чем 80-90 сплошного монослоя, затем проводили замену ростовой питательной среды на поддерживающую, состоящую из среды Игла и 2-3 сыворот 4 16858 1 2013.02.28 ки крови крупного рогатого скота. Для заражения клеток использовали штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свинейКМИЭВ-35 с титром 6,5-7,0 ТЦД 50/см 3, при множественности заражения 0,30,4 ТЦД 50 на клетку, который культивировали в термостате в течение 5-7 суток при температуре 37-38 . Снижение вносимой заражающей дозы вируса менее чем 0,3-0,4 ТЦД 50 на клетку ведет к увеличению времени культивирования вируса и к снижению его инфекционной активности, увеличение заражающей дозы вируса более 0,4 ТЦД 50 на клетку ведет к перерасходу посевного материала и не приводит к повышению инфекционного титра вируса. После появления цитопатогенного действия вируса на культуре клеток -145(монослой поражен на 80-90 ) матрасы с вирусом снимают с инкубирования в термостате и подвергают двукратному замораживанию при температуре 26 и оттаиванию при температуре 37 . Полученную культуральную вируссодержащую жидкость сливают в общую емкость, проверяют на стерильность на питательных средах и инактивируют теотропином в конечной концентрации 0,4-0,5 в течение 12-24 часов в термостате при температуре 37 . В инактивированный вирус вносят адъювант на основе минерального масла 52 в концентрации 50-60 об. Пример 2. Адаптация вируса РРСС к клеточным культурам. Штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней КМИЭВ-35, выделенный на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней, с инфекционным титром 3,5-4,0 ТЦД 50/см 3 адаптировали к перевиваемой культуре клеток -145 путем последовательных пассажей. Для повышения титра вируса проводили 15-20 последовательных пассажей на культуре клеток -145. После проведения 5-7 пассажей титр вируса возрос с 4,0 до 4,5-5,25 ТЦД 50/см 3. К 15-20-му пассажу титр вируса составлял 6,65-7,25 ТЦД 50/см 3. Дальнейшее проведение пассажей на этой культуре клеток не приводило к повышению инфекционного титра вируса (табл. 1). Таблица 1 Адаптация вируса РРСС к клеточным культурам Культура клеток и титр вируса РРСС ( ТЦД 50/см 3) Номера пассажей АМС Из табл. 1 видно, что достаточно высокий титр вируса РРСС (6,65-7,25 ТЦД 50/см 3) получен на 15-20 пассажах на культуре клеток -145. Проведение дальнейших пассажей вируса РРСС на культуре клеток -145 не приводило к повышению его активности. В культуре клеток -104 и -15 вирус не репродуцировался. Пример 3. Влияние множественности заражения вируса РРСС (ТЦД 50/клетка) на его накопление в культуре клеток -145. 5 16858 1 2013.02.28 Определяли оптимальное количество вируса РРСС, необходимое для заражения культуры клеток -145 с целью его максимального накопления. Изучали влияние множественности заражения вируса при внесении его на клетки и его накопление в них. Для этой цели определяли количество клеток в суспензии, вносимой в матрасы в камере Горяева по общепринятой методике. Вирус вносили в 12 матрасов с культурой клеток -145 в количестве 0,2 0,3 0,4 0,5 тканевых цитопатогенных доз на клетку (ТЦД 50/клетка) и инкубировали в термостате при 37 . В качестве контроля использовали один матрас с незараженной культурой клеток. Через 72, 96, 120 и 144 часа инкубации вируса при 37 по 3 матраса снимали в каждый из названных сроков. Матрасы с инфицированной культурой клеток дважды замораживали при 26 и оттаивали. Отбирали образцы культуральной вирусодержащей жидкости(по 5,0 см 3) и титровали на культуре клеток -145 по общепринятой методике. Титр вируса высчитывали по Риду и Менчу. Результаты исследования приведены в табл. 2. Таблица 2 Влияние множественности заражения вируса РРСС (ТЦД 50/клетка) на его накопление в культуре клеток -145 Множественность Титр вируса,ТЦД 50/мл,4 заражения вируса Время инкубирования вируса РРСС, часы РРСС (ТЦД 50/клетка) 72 96 120 144 0,2 1,80,5 4,850,13 6,80,04 6,850,12 0,3 2,20,9 5,250,11 7,250,20 7,250,09 0,4 3,20,05 5,200,07 7,200,25 7,200,10 0,5 3,00,04 5,00,16 7,00,03 7,00,05 Примечанияр 0,05 р 0,05. Из табл. 2 видно, что при множественности заражения 0,3-0,4 ТЦД 50/клетка вируса РРСС его инфекционная активность достигала максимального значения через 120-144 часа после заражения вирусом клеток и составляла 7,2-7,25 ТЦД 50/мл. Дальнейшее увеличение множественности заражения вирусом клеток практически не приводило к повышению выхода вируса и не влияло на его накопление в культуре клеток. Пример 4. Инактивация вируса РРСС теотропином. Определяли оптимальную концентрацию теотропина, необходимую для инактивации вируса (0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 об. ), и время, необходимое для полной инактивации вируса(1, 3, 6, 9, 12, 24, 72 часа) в термостате при 37 . Результаты исследования приведены в табл. 3. Таблица 3 Инактивация вируса РРСС теотропином Время инактивации вируса, часы Наименование инактиванта, п/п концентрация, об.1 3 6 9 12 24 72 1 0,1 2 0,2 3 0,3 4 0,4 Из табл. 3 видно, что тетропин в 0,4 -ной концентрации инактивирует вирус РРСС при 37 в термостате в течении 12-24 часов. Пример 5. Определение сорбционной активности адъювантов для вируса РРСС. Подбирали адъювант для инактивироанной вакцины РРСС, отрабатывали режим адсорбции вируса на носителях. В качестве адъюванта испытывали алюмокалиевые квасцы,активированную целлюлозу и эмульсиген на основе минерального масла 52. 6 16858 1 2013.02.28 Алюмокалиевые квасцы и целлюлозу испытывали в концентрациях 0,5 1,0 2,0 3,0 об. ,эмульсиген на основе минерального масла 52 - в объеме 50-60 . Смесь вируса и адъюванта в названных концентрациях выдерживали 16-18 часов при 4 , центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 минут, отбирали надосадочную жидкость и титровали ее на культуре клеток -145. По разнице титров вируса в исходном и опытном образцах судили о сорбционной активности испытуемых адъювантов. Результаты исследования приведены в табл. 4. Таблица 4 Сорбционная активность адъювантов для вируса РРСС Наименование адъюванта, концен п/п Титр вируса ( ТЦД 50/см 3) трация (об. ) Алюмокалиевые квасцы 1 0,5 5,250,10 2 1,0 5,00,08 3 2,0 5,20,13 4 3,0 5,150,09 Целлюлоза активированная 5 0,5 4,850,10 6 1,0 5,250,05 7 2,0 5,250,19 8 3,0 5,20,15 Эмульсиген на основе минерального масла 52 9 50 5,250,05 10 60 5,250,09 Примечаниер 0,05. Из табл. 4 видно, что алюмокалиевые квасцы в концентрации 0,5 об. , целлюлоза активированная в 1-2 -ной концентрации, эмульсиген на основе минерального масла 52 в объеме 50-60 являются оптимальными для абсорбции вируса РРСС. Пример 6. Определение антигенной и иммунологической активности вируса РРСС. Антигенную и иммуногенную активность вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней изучали на 6 кроликах живой массой 2,6-2,8 кг, из них 2 контрольных (не привитых). Четырем кроликам внутримышечно двукратно с интервалом 14 дней вводили вирус в дозах 2106,0-6,25 и 3106,0-6,25 ТЦД 50/см 3. Чрез 14 дней после второй иммунизации отбирали пробы крови, сыворотки крови исследовали в реакции нейтрализации на культуре клеток -145 с вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней. Титр кроличьей сыворотки к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней составил 6,06,8 лог 2. Вакцину считают иммуногенной, если титр вируснейтрализующих антител у кролика, иммунизированного внутримышечно, двукратно с интервалом 14 дней в дозах 2106,0-6,25 и 3106,0-6,25 ТЦД 50/см 3, составляет 4,0-5,0 лог 2. Таким образом, заявляемое изобретение позволяет сконструировать иммуногенную вакцину инактивированную против репродуктивно-респираторного синдрома свиней,предназначенную для иммунизации свиноматок, хряков-производителей и ремонтных свинок против названного заболевания. В способе ее производства используется штамм вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней КМИЭВ-35, выделенный в Беларуси. Для инактивации вируса используется теотропин, в качестве адъюванта - эмульсиген на основе минерального масла 52. Подобранные в оптимальных соотношениях компоненты вакцины инактивированной обеспечивают ее эффективность. 16858 1 2013.02.28 Источники информации 1. Патент 2.192887, МПК 761 39/12,12 7/00 // ( 12 7/00,12 1/93),2002. 2. ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных, ФГУ ВНИИЗЖ. Диагностика, профилактика и лечение инфекционных болезней свиней. - Владимир, 2007. - С. 24. 3. Патент 4432338 1, МПК 12 7/00,61 39/12,61 35/76,07 21 04, 12 7/04,12 15/33 //12 7/06, 1995. 4. Патент 2316346, МПК 61 39 12,12 7/00,61 31/12, 2006 (прототип). 5. Патент 4432338 1, МПК 12 7/00,61 39/12,61 35/76,07 21 04, 12 7/04,12 15/33 //12 7/06, 1995. 6. Орлянкин Б.Г. Непоклонов Е.А. Алипер Т.И. и др. Разработка инактивированной вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф.,посвященной 30-летию Всерос. науч.-исслед. и технолог. ин-та биолог. промышленности 8-9 июня 2000. - Щелково, 2000. - С. 89-91 (прототип). 7. Заявка 20050917, МПК 712 7/00, 2006. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8