Способ выделения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСА РЕПРОДУКТИВНОРЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(72) Авторы Ястребов Аскалон Сергеевич Савельева Тамара Александровна Пунтус Ирина Анатольевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(57) Способ выделения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней путем проведения пассажей патологического материала, полученного от больного поросенка, на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней, отличающийся тем, что проводят 2-3 пассажа патологического материала на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней, а затем до появления цитопатогенного действия вируса 3-5 пассажей на перевиваемой культуре клеток -145 в поддерживающей среде Игла,содержащей дополнительно 2-4 фетальной сыворотки крупного рогатого скота и трипсин в количестве 10-20 мкг на 1 мл среды, после чего собирают культуральную вируссодержащую жидкость. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и может быть использовано для изготовления вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) и диагностических наборов РРСС. Известен способ выделения штамма Лелистад, заключающийся в культивировании его на альвеолярных макрофагах свиней (АМС) в С 2-инкубаторе при 37 С 1. Недостатком способа 1 является его трудоемкость. Известны способы выделения вируса РРСС на клоповых вариантах перевиваемой линии клеток МА-104 -145, клетках 2621,-11171 2, 3. Недостатком способов 2, 3 является недостаточная чувствительность перевиваемых линий клеток к вирусу РРСС. Известен способ выделения американского штамма - из сыворотки крови поросят или надосадочной жидкости легочного гомогената, которые помещают на ячейки 2413139 1 2010.04.30 ячеечной планшеты, вносят клетки -145, суспендированные в среде Игла с добавкой 3 плодной бараньей сыворотки, 0,15 карбоната натрия и антибиотиков 4. Недостатком способа является то, что перевиваемая культура клеток -145 является чувствительной не для всех штаммов вирусов РРСС. Но она достаточно чувствительна для изолятов вируса РРСС, проявивших цитопатогенное действие на культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней (АМС). Известен способ выделения штамма -99/, который заключается в выделении из патологического материала от больных свиней путем предварительного пассирования на поросятах, а затем культивирования в СО 2-инкубаторе при 34 С на культуре клеток-145 со средой Игла , в которую вносят 10 фетальной сыворотки телят 5. Недостаток названного способа выделения вируса РРСС заключается в его трудоемкости и длительности выполнения по времени. Задачей изобретения является упрощение способа выделения вируса РРСС. В связи с тем, что имеются различия в нуклеотидной последовательности в геноме вирусов РРСС, выделенных в Европе и Беларуси, вирус выделяют непосредственно в хозяйствах Беларуси. Поставленная задача достигается тем, что в способе выделения вируса репродуктивнореспираторного синдрома свиней путем проведения пассажей патологического материала,полученного от больного поросенка, на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней - проводят до 2-3 пассажа патологического материала на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней, а затем до появления цитопатогенного действия вируса 3-5 пассажей на перевиваемой культуре клеток -145 в поддерживающей среде Игла, содержащей дополнительно 2-4 фетальной сыворотки крупного рогатого скота и трипсин в количестве 10-20 мкг/мл среды, после чего собирают культуральную вируссодержащую жидкость. В качестве объекта выделения вируса используется штаммродаКМИЭВ-35. Используемый штамм характеризуется Таксономическая принадлежность. Штамм вируса РРСС КМИЭВ-35 относится к семейству , роду , виду. Морфологические признаки штамма вируса РРСС КМИЭВ-35. Вирионы диаметром 45-70 нм, их плавучая плотность в сахарозе составляет 1,13-1,17 г/см 3, хлористом цезии 1,17-1,20 г/см 3. Вирус репродуцируется в цитоплазме клетки, чувствителен к хлороформу и эфиру, колебаниям рН ниже 5,0 и выше 7,0. Снижает свою активность при 37 С через 3 ч, при 20 С - через 20 ч, при 56 С - через 6 мин. Инактивируется при 56 С в течение 45 мин. Биологические свойства. Штамм вируса РРСС не обладает гемагглютинирующими свойствами по отношению к эритроцитам крупного рогатого скота, кролика, кур, лошади,морской свинки, свиньи, крысы и человека. Обладает антигенными свойствами, не чувствителен к антибиотикам. Культивирование. Вирус РРСС репродуцируется в легочных альвеолярных макрофагах свиней. Чувствительными к вирусу являются 2 кленовых варианта перевиваемой линии клеток МА-1042621 и -145. Вирулентность. Штамм вируса РРСС КМИЭВ-35 патогенен для свиней и не патогенен для лабораторных животных (кролика, морской свинки, белой мыши). Для выделения штаммародаКМИЭВ-35 первоначально используют первичную культуру клеток альвеолярных макрофагов свиней, а затем перевиваемую культуру клеток -145. До выделения вируса РРСС на культуре клеток осуществляют следующие подготовительные операции в качестве патологического материала для заражения культуры клеток альвеолярных макрофагов свиней используют сыворотку крови, полученную от слабых и 2 13139 1 2010.04.30 нежизнеспособных новорожденных поросят, или патматериал (легкие, портальные лимфоузлы, селезенку, тонзилы, транссудат из грудной полости) от больных и мертворожденных поросят. Из патматериала готовят 20 -ную суспензию, которую центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 минут, надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками (гентамицин из расчета 100 мкг/мл, амфотерицин 2,5 мг/мл), выдерживают в течение 60 минут при комнатной температуре, проверяют на стерильность на питательных средах(МПБ, МПА, МППБ, среда Сабуро) и замораживают при -26 С. Для получения первичной культуры клеток альвеолярных макрофагов свиней используют клинически здоровых поросят в возрасте 6-8 недель, не содержащих антител к вирусу РРСС, из свиноводческих хозяйств, благополучных по инфекционным болезням. Животных убивают, извлекают легкие, вымывают легочные макрофаги по методике,предложенной С.А. Кукушкиным с соавторами 6. Количество клеток АМС подсчитывают в камере Горяева и их концентрацию в суспензии доводят до 3-6106 клеток/мл. Взвесь клеток вносят в пластиковые матрасы объемом 50-200 см 3, с ростовой средой, инкубируют при 37 С в течение 24 ч в СО 2-инкубаторе с содержанием 5 углекислоты. Ростовую среду сливают, монослой клеток промывают средой Игла, вносят стерильную надосадочную жидкость, полученную из патматериала путем центрифугирования при 4000 об/мин в течение 30 мин, обработанного антибиотиками, в объеме 10 от объема поддерживающей среды. После инкубирования патматериала в течение 60 мин при 34-37 С его сливают, монослой трижды промывают средой Игла и вносят свежую поддерживающую среду Игла, обогащенную 2-4 фетальной сыворотки крупного рогатого скота, трипсином из расчета 10-20 мкг/мл, гентамицина сульфата из расчета 50 мкг/мл, амфотерицина В или канамицина 2,5 мг/мл, глютамина 0,3 мг/мл. Инкубирование инфицированных клеток АМС проводили в СО 2-инкубаторе в течение 4-5 дней с ежедневной микроскопией монослоя клеток. Пример 1. Выделение вируса. Проводили до 2-3 последовательных пассажей патологического материала на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиней, так как в первых пассажах патматериала ЦПД может отсутствовать. Полученную культуральную жидкость после двукратного замораживания и оттаивания, обработанную трипсином в количестве 1020 мкг на 1 мл среды, по 0,2-0,4 мл вносили в пробирки с перевиваемой культурой клеток-145. Для работы использовали культуру клеток -145 на 2-й день роста клеток, когда монослой клеток не был полностью сформирован (логарифмическая фаза роста клеток) - 70-75 монослоя. Инкубирование культуральной жидкости проводили в термостате при 34-37 С в течение 60 мин. Культуральную жидкость сливали, монослой клеток промывали средой Игла и вносили в каждую пробирку по 1,0 мл свежей поддерживающей среды Игла с добавлением 2-4 фетальной сыворотки крупного рогатого скота, гентамицина сульфата из расчета 50 мкг/мл, амфотерицина В и канамицина - 2,5 мг/мл и глютамина - 0,3 мг/мл. Инкубирование клеток проводили в термостате при 34-37 С в течение 37 дней, ежедневно микроскопировали монослой клеток с целью обнаружения цитопатического действия вируса РРСС. Проводили 3-5 последовательных пассажей патологического материала до появления ЦПД вируса. Пример 2. Титрование вируса. Вирус РРСС титровали на культуре клеток -145. Делали десятикратные разведения вируса, начиная от 10-1 до 10-7, на каждое разведение вируса использовали 4 пробирки с культурой клеток. Каждое разведение вируса вносили по 0,1 мл на пробирку,предварительно сливали ростовую среду и монослой клеток промывали средой Игла. Вирус на культуре клеток инкубировали в термостате при 34-37 С в течение 5-7 дней, ежедневно микроскопировали культуру клеток. Цитопатическое действие вируса проявлялось с 3-5 дня и длилось до 7 суток. Окончательно результаты микроскопии учитывали на 5-7 13139 1 2010.04.30 день инкубирования. Титр вируса высчитывали по методу Рида и Менча. Результаты титрования штамма вируса РРСС КМИЭВ-35 приведены в табл. 1. Таблица 1 Инфекционный титр штамма вируса РРСС КМИЭВ-35 на культуре клеток -145 Кол-во Учет результатов ЦПД вируса в пробирках с культурой клеток Разведение пробипо дням вируса рок 18.06.02 19.06.02 20.06.02 23.06.02 24.06.02 25.06.02 10-1 4 4/0 4/0 4/4 4/4 4/4 4/4(незаражен 4 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 ная культура клеток) Примечания 1) Заражение культуры клеток штаммом вируса РРСС произведено 18.06.02, окончательный учет результатов титрования - 25.06.02 г. 2) В числителе - количество пробирок с культурой клеток, взятых в опыт, в знаменателе - количество пробирок с клетками, в которых отмечено ЦПД вируса. Титр вируса РРСС, высчитанный по методу Рида и Менча, составил 5,76 ТЦД 50/мл. Пример 3. Идентификация вируса. Идентификацию выделенного вируса РРСС проводили в перекрестной реакции нейтрализации на культуре клеток -145 с использованием иммунной сыворотки крови свиней или кроликов к эталонному штамму вируса РРСС, нормальной сыворотки крови здорового поросенка, свободной от антител к вирусу РРСС (контроль) и положительной сыворотки крови к парвовирусу свиней (контроль). Реакцию нейтрализации ставили по общепринятой методике с постоянной дозой вируса (100 ТЦД 50) и разведением сывороток 15-110. Результаты исследований учитывали в течение 7 дней и приведены в табл. 2. Таблица 2 Идентификация вируса РРСС КМИЭВ-35 в реакции нейтрализации на культуре клеток -145 Количество Учет результатов исследования по дням Наименование пробирок с вируса и сывоп/п культурой 13.05.02 14.05.02 15.05.02 16.05.02 17.05.02 ротки клеток Эталонный 1. штамм вируса 4 4/1 4/2 4/3 4/4 4/4 РРСС Эталонный штамм вируса РРСС 2. 4 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 иммунная сыворотка к вирусу РРСС 13139 1 2010.04.30 Продолжение таблицы 2 Количество Учет результатов исследования по дням Наименование пробирок с вируса и сывоп/п культурой ротки клеток 13.05.02 14.05.02 15.05.02 16.05.02 17.05.02 Эталонный штамм вируса РРСС 3. 4 4/2 4/2 4/3 4/4 4/4 нормальная сыворотка свиней (контроль) Эталонный штамм вируса РРСС 4. 4 4/1 4/1 4/2 4/4 4/4 сыворотка к парвовирусу свиней Изолят вируса 5. 4 4/1 4/1 4/2 4/3 4/4 РРСС Изолят вируса РРСС 6.иммунная 4 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 сыворотка к вирусу РРСС Изолят вируса РРСС 7.нормальная 4 4/1 4/1 4/3 4/4 4/4 сыворотка свиней (контроль) Изолят вируса РРССсыворотка к 8. 4 4/1 4/1 4/2 4/3 4/4 парвовирусу свиней (контроль) Незараженная культура кле 9. 4 4/0 4/0 4/0 4/0 4/0 ток -145(контроль) Примечания 1) Заражение культуры клеток -145 вирусами РРСС проводили 10.05.02, окончательные результаты опыта учитывали 17.05.02 2) эталонный вирус РРСС и изолят вируса РРСС КМИЭВ-35 разводили средой Игла 1100 3) Иммунную сыворотку и вирус РРСС, парвовирусу и нормальную сыворотку здорового поросенка разводили средой Игла 15 4) В числителе - количество пробирок с культурой клеток в опыте, в знаменателе - количество пробирок с культурой клеток, в которых отмечено ЦПД вируса. Из табл. 2 видно, что вирус РРСС КМИЭВ-35, как и эталонный штамм вируса РРСС, нейтрализуется антителами иммунной сыворотки к эталонному штамму вируса РРСС и проявляет цитопатогенное действие на культуре клеток -145 в присутствии 5 13139 1 2010.04.30 нормальной сыворотки здорового поросенка и антисыворотки к парвовирусу свиней. Полученные результаты указывают на то, что вирус РРСС КМИЭВ-35 является вирусом РРСС. Пример 4. Вирулентность вируса для лабораторных животных и свиней. Вирулентность изолята вируса РРСС испытывали на лабораторных животных (кроликах, морских свинках, белых мышах) и поросятах. Для этой цели в опыте использовали 5 кроликов живой массой 2,0-2,4 кг, 5 морских свинок, 10 белых мышей живой массой 1618 г, 2 клинически здоровых поросенка в возрасте 5 недель живой массой 13-15 кг. Вирус выращивали на культуре клеток -145 стационарно в 1,5-литровом биологическом матрасе. После проявления цитопатогенного действия вируса на клетках на 4-6-й дни после заражения биологический матрас с вируссодержащей жидкостью дважды замораживали и оттаивали. Для заражения животных использовали культуральную вируссодержащую жидкость, которую вводили внутримышечно кроликам в объеме 5,0 мл, морским свинкам - 3,0 мл, подкожно белым мышам по 0,5 мл, интранозально поросятам - 5,0 мл. За зараженными животными вели клиническое наблюдение в течение 10 дней. Лабораторные животные (кролики, морские свинки, белые мыши) оставались клинически здоровыми в течение 10-дневного срока наблюдения. У 2-х поросят, которым вводили вирус РРСС, на 4-5-й день отмечали угнетение, отказ от корма, затрудненное дыхание, конъюнктивиты, посинение кожи ушей и подгрудка. Температура тела на 4-5-й день после заражения была повышена на 0,2-0,8 С, после чего приходила постепенно к норме. В дальнейшем животные выздоравливали. Таким образом, штаммродаКМИЭВ-35 патогенен для свиней и не патогенен для лабораторных животных (кроликов,морских свинок, белых мышей). Может быть использован для конструирования вакцины против РРСС после изучения его антигенной активности и иммунногенных свойств. Способ выделения вируса РРСС КМИЭВ-35 требует меньших затрат, так как нет необходимости в проведении предварительного пассирования вируса на поросятах. Выделенный штамм вируса РРСС КМИЭВ-35, изолированный непосредственно в хозяйстве на территории Республики Беларусь, может быть использован для изготовления вакцины против РРСС и диагностических наборов РРСС. Источники информации 1..,С.,.// . . - 1991. - . 13. - . 121-130. 2.,,,,2621-// . . . . - 1993. - . 5. - . 163-165. 3.,.,-104// . . 1993. - . 133. -3-4. - . 477-483. 4. Патент РФ 2192887, 1996. 5. Дудникова Н.С., Пыльнов В.А., Гусева Е.В., Дудников С.А., Канышина А.В. Выделение вируса РРСС и его адаптация к перевиваемой линии клеток 145 // Ветеринария. - 2000. -10 (прототип). 6. Кукушкин А.С., Дудникова Н.С., Андреев В.Г., Каньшина А.В., Байбиков Т.З. Методические рекомендации по выделению вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней с использованием альвеолярных макрофагов свиней. - Владимир, 2000. - 10 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6