Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физикоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Бильдюкевич Александр Викторович Власов Леонид Евгеньевич Павлович Татьяна Александровна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ получения тромбина, включающий взаимодействие протромбина с тромбопластином в присутствии хлорида кальция, добавление буферного раствора, предварительную фильтрацию и тонкую очистку полученного раствора тромбина, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют цитратный буфер с 5,5-7,3, тонкую очистку раствора осуществляют последовательной ультрафильтрацией через селективно проницаемые мембраны при разности давлений от 0,2 до 2,0 атм, при этом вначале ультрафильтрацию осуществляют через селективно проницаемую мембрану с номинальным молекулярно-массовым пределом 100-300 кДа, а затем через мембрану с номинальным молекулярно-массовым пределом 10-20 кДа. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный раствор тромбина разливают по флаконам, подвергают лиофильной сушке и укупоривают. Изобретение относится к высокоэффективным и экономически выгодным способам получения тромбина для лабораторных медицинских исследований. Метод получения тромбина может быть реализован в лабораторном и промышленном масштабах. Тромбин обычно получают из неочищенного продукта тромбина с помощью хроматографических методов с использованием в качестве разделительных сред различных ионообменных полимеров. Обычно используется многоэтапная хроматография с перемежающимся использованием анионо- и катионообменных сред 1. Эти множественные этапы хроматографии связаны со значительными временными и энергетическими затратами, и увеличивают стоимость этого способа, и часто неприемлемы для широкомасштабного производства тромбина. Известен способ получения тромбина из неочищенного продукта тромбина с помощью ионообменной хроматографии с использованием одной активированной сульфосалицилом полисахаридной среды и элюирующего агента трех различных концентраций 2. В извлеченном элюате с максимальным содержанием тромбина производят замену буфера и 17409 1 2013.08.30 осуществляют дополнительное фильтрование полученного раствора тромбина через целлюлозную половолоконную мембрану. Известный способ также характеризуется сложностью и многостадийностью (использование ионообменной хроматографии и мембранного разделения), длительностью проводимых процедур, значительными потерями тромбина и его низкой активностью. Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения жидкого препарата тромбина, заключающийся во взаимодействии протромбина с тромбопластином в присутствии хлорида кальция, добавлении к полученному продукту 0,5-1,5 М фосфатного буферного раствора сот 6 до 7 и последующей тонкой очистке препарата, описанный в 3. Перед тонкой очисткой раствора тромбина от присутствующих в нем примесей по известному способу осуществляют его разбавление водой и осветляющую фильтрацию. Тонкую очистку проводят последовательной подачей полученного фильтрата на разделение вначале в колонку с анионообменным носителем, а затем в колонку с катионообменным носителем. Тромбин элюируется из первой колонны фосфатным буфером с концентрацией 0,1 моль/л, а из второй - последовательно двумя видами этого же буфера с концентрацией 0,17 и 0,28 моль/л соответственно. К недостаткам известного способа следует отнести сложность технологического процесса (особенно на стадии тонкой очистки препарата), требующего сложного аппаратурного оформления значительные потери тромбина на ионообменных колонках низкую степень чистоты тромбина недостаточно высокую коагулогическую активность тромбина. Перечисленные недостатки устраняются в заявленном способе получения тромбина. Задачей настоящего изобретения является упрощение и удешевление технологии получения тромбина, снижение потерь целевого продукта и увеличение его стабильности. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения тромбина взаимодействием протромбина с тромбопластином в присутствии хлорида кальция, добавлением к полученному продукту буферного раствора, предварительной фильтрацией и последующей тонкой очисткой полученного раствора тромбина в качестве буферного раствора используют цитратный буфер с 5,5-7,3, тонкую очистку раствора осуществляют последовательной ультрафильтрацией через селективно проницаемые мембраны при разности давлений от 0,2 до 2,0 атм. При этом вначале ультрафильтрацию осуществляют через селективно проницаемую мембрану с номинальным молекулярно-массовым пределом задерживания (НММП) 100-300 кДа, а далее ультрафильтрацию ведут через мембрану с НММП 10-20 кДа. Половолоконные полисульфоновые мембраны с различным значением НММП выпускаются по ТУ 100185198.091-2008 ГНУ 4, полые волокна ВПУ-15 ПА разработаны на Государственном предприятии Всероссийский научно-исследовательский институт полимерных волокон с опытным заводом 5. На первой стадии очистки происходит удаление высокомолекулярных балластных соединений методом диафильтрации при постоянном объеме, на второй стадии происходит концентрирование тромбина ультрафильтрацией с одновременным удалением низкомолекулярных примесей. Для получения сухого тромбина очищенный раствор тромбина разливают по флаконам, проводят лиофильную сушку, укупорку флаконов под вакуумом и завальцовку алюминиевыми колпачками. Преимущества предлагаемого способа следующие относительная простота аппаратурного оформления отсутствие необходимости использования дорогостоящих реактивов и сорбентов высокая производительность и возможность практически неограниченного масштабирования процесса разделения 2 17409 1 2013.08.30 возможность совмещения процесса концентрирования тромбина с отделением его от низкомолекулярных примесей ультрафильтрация, являясь мягким методом разделения, позволяет в максимальной степени сохранить нативные свойства целевого продукта использование цитратного буфера вместо фосфатного способствует сохранению активности и не приводит к выпадению осадка фосфата кальция, что облегчает процесс очистки жидкого препарата тромбина. Проведен электрофоретический анализ образцов тромбина, выделенных с помощью ультрафильтрации, и тромбина, выделенного хроматографически. Результаты электрофоретического анализа отражены на фигуре а) тромбина, выделенного с помощью ультрафильтрации по примеру 1,б) тромбина, выделенного с помощью ультрафильтрации по примеру 3,в) тромбина, выделенного с помощью ультрафильтрации по примеру 20,г) тромбина, выделенного хроматографическим путем. По результатам приведенного анализа было установлено, что тромбин, выделенный с помощью ультрафильтрации (фиг. а-в), по своей чистоте не уступает тромбину, выделенному с помощью ионообменной хроматографии (фиг. г), поскольку в обоих случаях на электрофореграммах наблюдаются белки с электрофоретической подвижностью, соответствующей преимущественно фракциям -1- и -2-глобулинов. Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. 100 г протромбинового комплекса измельчают и суспендируют в 200 см 3 2 -ного раствора хлорида натрия, охлажденного до 1 С. Корректируют значениедо 6,5 с помощью раствора гидроксида натрия с концентрацией 1 г/л. К полученной суспензии добавляют 100 см 3 охлажденной дистиллированной воды, и 1,25 г тромбопластина со свертывающей активностью 11-18 с по тесту протромбиновое время 6, и 10 мл 5 -ного раствора кальция хлорида. После перемешивания в течение 3-х часов к реакционной массе добавляют цитратный буфер с 6,550 мМ в количестве, обеспечивающем содержание общего белка в растворе 0,35 г/л 7. Полученный раствор, содержащий тромбин, предварительно фильтруют через набор микрофильтров с диаметром пор 0,8, 0,45 и 0,22 мкм и затем подают на тонкую очистку. Тонкую очистку препарата осуществляют последовательной ультрафильтрацией на половолоконных полисульфоновых мембранах ПС-300 (НММП 300 кДа) и ПС-20(НММП 20 кДа). Для проведения ультрафильтрации используют специально сконструированный стенд, состоящий из шестеренчатого насоса (тип .68,.),мембранного элемента с рабочей площадью мембран 0,1 м 2, подсоединенного шлангами из поливинилхлорида к насосу, и емкости с питающим раствором. Рабочее давление на входе - 1,7 атм, на выходе - 0,7 атм. На первой стадии ультрафильтрационной очистки производят отделение тромбина от присутствующих в растворе более высокомолекулярных примесей с помощью мембраны с НММП 300 кДа. Ультрафильтрацию проводят до тех пор, пока в фильтрат не переходит 80 от объема исходного раствора белка, а в концентрате остается 20 . После чего производят отбор пробы концентрата для определения коагулогической (свертывающей) активности по тесту тромбиновое время (ТВ) 6. Оставшийся концентрат разбавляют раствором нитратного буфера до исходного объема, после чего полученный раствор снова подвергают фракционированию на вышеуказанной мембране. Когда объем концентрата снова составляет 20 от исходного, фильтрацию прекращают и производят отбор проб,после чего следует его разбавление буферным раствором и дальнейшее фракционирование. Разбавление повторяют до тех пор, пока в концентрате не перестает наблюдаться коагулогическая активность по тесту ТВ. Далее полученный фильтрат концентрируют с помощью половолоконной мембраны ПС-20. На данной стадии происходит совмещение процесса концентрирования тромбина с 3 17409 1 2013.08.30 отделением его от низкомолекулярных примесей примеси уходят в фильтрат, а тромбин остается в концентрате. Во время фильтрации проводят постоянный контроль коагулогической активности питающего раствора. Фильтрацию прекращают в тот момент, когда коагулогическая активность питающего раствора по тесту ТВ составит 11-17 с. Для получения сухого тромбина концентрат тромбина распределяют по флаконам объемом до 10 см 3, флаконы отправляют на лиофильную сушку. Сушку осуществляют по известным методикам 8-9. По окончании сушки производят укупорку флаконов под вакуумом и завальцовку алюминиевыми колпачками. Примеры 2-19. Выполняют аналогично примеру 1.и концентрация используемого цитратного буфера (цитр), разность рабочих давлений на входе и выходе , а также используемые мембраны указаны в табл. 1. Таблица 1 Условия тонкой очистки для примеров 1-19 Мембрана Пример, цитр, мМ 1 ПС-300 ПС-20 6,5 1,0 50 2 ПС-300 ПС-10 6,5 0,2 50 3 ПС-100 ПС-20 7,2 0,3 55 4 ПС-100 ПС-10 6,8 0,4 60 5 ПС-100 ПС-20 6,7 0,5 70 6 ПС-300 ВПУ-15 ПА 6,5 0,6 62 7 ПС-300 ПС-10 6,3 0,7 50 8 ПС-100 ПС-10 7,0 0,8 70 9 ПС-100 ПС-20 5,5 0,9 55 10 ПС-300 ВПУ-15 ПА 6,7 1,1 60 11 ПС-100 ПС-20 7,2 1,2 45 12 ПС-300 ПС-10 6,5 1,3 50 13 ПС-300 ПС-20 5,5 1,4 65 14 ПС-100 ПС-10 7,3 1,5 75 15 ПС-300 ПС-20 6,6 1,6 50 16 ПС-100 ПС-10 6,0 1,7 65 17 ПС-100 ВПУ-15 ПА 7,2 1,8 50 18 ПС-300 ПС-20 6,9 1,9 60 19 ПС-300 ПС-20 7,3 2,0 55 Пример 20. Выполнение способа осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что ультрафильтрацию на первой мембране ПС-300 проводят, поддерживая объем исходного раствора постоянным, путем добавления цитратного буферного раствора. Фильтрацию также проводят до тех пор, пока в концентрате не перестанет наблюдаться свертывающая активность по тесту ТВ. Далее используют мембрану на основе полисульфона с НММП 20 кДа,как описано в примере 1. Примеры 21-38. Способ получения тромбина аналогичен примеру 20.и концентрация используемого цитратного буфера, разность давлений на входе и выходе, а также используемые мембраны указаны в табл. 2. Тонкую очистку осуществляют при разности давлений 0,2-2,0 атм. Увеличение разности давления выше 2,0 атм приводит к уплотнению мембраны, уменьшению диаметра пор,изменению селективности разделения и, как правило, к снижению производительности.менее 0,2 атм недостаточно для проведения процесса разделения. 4 17409 1 2013.08.30 Таблица 2 Условия тонкой очистки для примеров 20-38 Мембрана Пример, цитр, мМ 20 ПС-300 ПС-20 6,5 1,0 50 21 ПС-100 ПС-10 6,6 0,2 50 22 ПС-100 ПС-20 7,0 0,3 70 23 ПС-300 ПС-20 6,3 0,4 65 24 ПС-100 ПС-20 5,9 0,5 55 25 ПС-100 ПС-10 6,9 0,6 40 26 ПС-300 ВПУ-15 ПА 7,2 0,7 55 27 ПС-300 ПС-20 7,0 0,8 60 28 ПС-100 ПС-20 5,7 0,9 60 29 ПС-300 ПС-20 7,0 1,1 55 30 ПС-100 ПС-10 6,8 1,2 45 31 ПС-300 ПС-10 6,5 1,3 50 32 ПС-100 ПС-10 7,3 1,4 75 33 ПС-100 ПС-20 6,8 1,5 65 34 ПС-100 ВПУ-15 ПА 6,5 1,6 80 35 ПС-300 ПС-20 6,0 1,7 50 36 ПС-300 ПС-10 7 Д 1,8 45 37 ПС-300 ПС-10 7,0 1,9 55 38 ПС-100 ПС-20 7,0 2,0 55 Проведен сравнительный анализ коагулогической активности (КА) по тесту ТВ раствора тромбина, полученного с помощью ультрафильтрации, с раствором тромбина, выделенного хроматографическим путем. Для проведения анализа были приготовлены растворы тромбина с одинаковыми значениями концентраций общего белка (общ.). Данные по сравнительному анализу приведены в табл. 3. Таблица 3 Сравнительный анализ коагулогической активности образцов тромбина,выделенных различными способами Образец общ, г/л КА, с Тромбин, выделенный хроматографическим путем 1,00 20,6 Тромбин, выделенный с помощью ультрафильтрации (пример 1) 1,00 17,2 Тромбин, выделенный с помощью ультрафильтрации (пример 3) 1,00 17,9 Тромбин, выделенный с помощью ультрафильтрации (пример 20) 1,00 16,8 Из табл. 3 видно, что тромбин, выделенный с помощью ультрафильтрации, обладает более высокой коагулогической активностью (время свертывания плазмы крови меньше) по сравнению с тромбином, выделенным хроматографическим путем. Полученные данные являются подтверждением того, что ультрафильтрация является более мягким методом разделения белковых веществ и способствует сохранению нативных свойств целевого продукта. Тромбин, полученный данным способом, обладает высокой стабильностью. Время свертывания плазмы крови по тесту ТВ остается неизменным даже спустя 24 ч хранения рабочего раствора тромбина при температуре 18-24 С и более 72 ч при хранении раствора при 2-8 С. Тромбин, полученный предлагаемым способом, пригоден для применения в качестве реагента для скрининговых исследований, направленных на выявление возможных нару 5 17409 1 2013.08.30 шений в системе свертывания крови. Тромбин характеризуется высокой удельной активностью и устойчивостью при хранении. Источники информации 1. Патент США 6168938, МПК 12 9/74, 1998. 2. Патент РФ 2144081, МПК 12 9/74,61 35/16,61 38/48, 1995. 3. Патент США 5151355, МПК 12 9/74,61 37/547, 1992. 4. ТУ 100185198.091-2008. Мембраны ультра- и микрофильтрационные полимерные. 02.03.2009. 5. ТУ РФ 6-12-151-87. Волокно полое ультрафильтрационное марки ВПУ-15 ПА. 6. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. - М. Ньюдиамед, 2001. 7. , ,. - . 16. - . 40-48. - 1946. 8. Патент РФ 2111426, МПК 26 5/06, 1995. 9.. . .,. - 1992. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6

МПК / Метки

МПК: C12N 9/74

Метки: способ, получения, тромбина

Код ссылки

<a href="https://by.patents.su/6-17409-sposob-polucheniya-trombina.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ получения тромбина</a>

Похожие патенты