Способ получения средства, обладающего антикоагулянтным действием

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Иванов Олег Александрович Домаш Валентина Иосифовна Красненкова Татьяна Петровна Афонин Виктор Юрьевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения средства, обладающего антикоагулянтным действием, при котором корневища эхинацеи пурпурной моют, сушат при 37-40 С в течение 20-24 ч, измельчают до порошкообразного состояния, экстрагируют при 20-23 С в течение 12-16 ч дистиллированной водой, которую берут из расчета 10 мл на 1 г сырья, центрифугируют при 60007000 об/мин в течение 20-30 мин, из полученной надосадочной жидкости осаждают белки сульфатом аммония при 80-85 -ном насыщении в течение 24 ч, центрифугируют при 6000-7000 об/мин в течение 20-30 мин, полученный осадок подвергают гель-фильтрации на сорбенте акрилекс Р-30 с получением активной по отношению к тромбину фракции пептидов с молекулярной массой менее 6 кДа, осуществляют диализ против дистиллированной воды при 20-25 С в течение 6-8 ч с получением обессоленного раствора, который подвергают лиофильной сушке до порошкообразного состояния. Изобретение относится к способам получения биологически активного средства природного происхождения, которое может быть использовано в фармакологии, медицине и биохимии. Известен способ получения природного ингибитора коагуляции из тканей или секреций пиявок отряда , заключающийся в экстракции белковых компонентов смесью вода/ацетон, центрифугировании и аффинной и жидкостной хроматографии 1. Но этот способ обладает недостатками, так как требует наличия дорогостоящего материала животного происхождения и относительно трудоемок. Известен также способ получения средства с антикоагулянтной активностью из природных источников. Способ включает экстракцию нативного сапропеля 0,05 М раствором 16665 1 2012.12.30 аммиака. Экстракт концентрируют упариванием, центрифугируют при 3000-4000 и диализируют через целлофан, а недиализирующуюся фракцию упаривают досуха 2. Указанный способ обладает недостатком, заключающимся в том, что требует использования вредных веществ (аммиак). Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения средства, обладающего антикоагулянтным, фибринолитическим, антитромбоцитарным, антитромботическим и тромболитическим действием, из сухих корневищ пионапутем их экстракции дистиллированной водой из расчета на 1 г сырья 50 мл воды, кипячения экстракта на водяной бане, настаивания в темноте 20-24 ч при 37 С, центрифугирования при 3000 об/мин в течение 30-40 мин, доведения надосадочной жидкости до первоначального объема, замораживания ее с последующей лиофильной сушкой 3. Указанный способ обладает следующим недостатком. Полученное биологически активное вещество представляет собой сумму неочищенных, экстрагированных из корневищсоединений, что повышает возможность развития побочных эффектов при его использовании. Технической задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента средств растительного происхождения, обладающих антикоагулянтным действием, и повышение степени очистки целевого биологически активного продукта. Для решения поставленной задачи в способе получения средства, обладающего антикоагулянтным действием, корневища эхинацеи пурпурной моют, сушат при 37-40 С в течение 20-24 ч, измельчают до порошкообразного состояния, экстрагируют при 20-23 С в течение 12-16 ч дистиллированной водой, которую берут из расчета 10 мл на 1 г сырья,центрифугируют при 6000-7000 об/мин в течение 20-30 мин, из полученной надосадочной жидкости осаждают белки сульфатом аммония при 80-85 -ном насыщении в течение 24 ч, центрифугируют при 6000-7000 об/мин в течение 20-30 мин, полученный осадок подвергают гель-фильтрации на сорбенте акрилекс Р-30 с получением активной по отношению к тромбину фракции пептидов с молекулярной массой менее 6 кДа, осуществляют диализ против дистиллированной воды при 20-25 С в течение 6-8 ч с получением обессоленного раствора, который подвергают лиофильной сушке до порошкообразного состояния. Пример 1 Получение средства. Берут корневища эхинацеи пурпурной ( ), моют холодной водой,высушивают в термостате при температуре 37-40 С в течение 20-24 ч, после чего корни измельчают на лабораторной мельнице до порошкообразного состояния. Взвешивают 1 г порошка и заливают 10 мл дистиллированной воды при температуре 20-23 С, настаивают 12-16 ч, затем центрифугируют при 6000-7000 об/мин в течение 20-30 мин. Осадок отделяют, а из надосадочной жидкости осаждают белки сульфатом аммония при 80-85 -ном насыщении в течение 24 часов, затем центрифугируют при 6000-7000 об/мин в течение 20-30 мин, затем осадок растворяют в 50 мМ трисбуфере с 7,6 и проводят гельфильтрацию на колонке с акрилексом Р-30 4 в качестве сорбента. Элюцию ведут тем же буфером при скорости 20 см 3/час. На коллекторе фракций собирают активные по отношению к тромбину фракции, содержащие пептиды с молекулярной массой менее 6 кДа, полученные общеизвестным методом. Затем осуществляют диализ против дистиллированной воды при 20-25 С в течение 6-8 ч с получением обессоленного раствора, который подвергают лиофильной сушке до порошкообразного состояния. Для оценкиантитромбиновой активности получаемых фракций их анализируют известным способом, заключающимся в том, что берут 100 мкл раствора и в спектрофотометрической кювете смешивают с 3 мл раствора, содержащего 3 мг/мл фибриногена. К этой смеси приливают 75 мкл тромбина (15 /мл) и перемешивают. Измеряют по 2 16665 1 2012.12.30 глощение при 350 нм в течение 10 мин 5. Фракции, обладающие активностью в отношении тромбина, объединяют и диализируют для обессоливания, например, против 100 объемов дистиллированной воды 6-8 ч при 20-25 С. Диализированный раствор затем лиофилизируют до порошкообразного состояния и получают более очищенное средство,что подтверждается меньшим количеством электрофоретических компонентов по сравнению с прототипом. Так, в прототипе насчитывалось около 30 электрофоретических компонентов, а в заявляемом способе насчитывалось 5. Пример 2 Оценка антикоагулянтной активности средства. Для проверки антикоагулянтной активности на животных из крыс формируют две группы. Контрольной группе внутривенно вводят воду для инъекций, опытной группе животных вводят внутривенно раствор исследуемого препарата в дозе 170 мкг/кг массы тела. Забор крови осуществляют через 2 часа. Препарат на 81 увеличивает по сравнению с контролем тромбиновое время и тромбопластиновое время на 12(таблица). Показатели коагуляции крови у крыс через 2 часа после внутривенного введения препарата ингибиторов тромбина. Контрольная группа Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), с Таким образом, совокупность признаков заявленного изобретения позволяет получить средство, расширяющее ассортимент средств растительного происхождения с повышенной степенью очистки, обладающее антикоагулянтным действием, которое может быть использовано в медицине в качестве антитромбического средства. Источники информации 1. Патент 2138275, МПК 661 35/62 // Бюл.27. - 27.09.1999. 2. Патент 2101023, МПК 661 35/78, 10.01.1998. 3. Патент 2199331, МПК 661 35/7861 7/00 // Бюл.6. - 27.02.2003 (прототип). 4. Акрилекс. Гелевые фильтры Паспорт на гелевые фильтры фирмы Реанал. - С. 7. 5. // .. . - 1974. - . 60. - . 1. . 175-184. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3