Способ получения фимбриальных адгезинов колибактерий

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИМБРИАЛЬНЫХ АДГЕЗИНОВ КОЛИБАКТЕРИЙ(71) Заявители Зайцев Владимир Владимирович Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Алеся Владимировна(72) Авторы Зайцев Владимир Владимирович Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Алеся Владимировна(73) Патентообладатели Зайцев Владимир Владимирович Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Алеся Владимировна(56) Ломако Ю.В. Ученые записки Витебской ордена Знак Почета государственной академии ветеринарной медицины. - Витебск, 2002. - Т. 38. - Ч. 1. С. 66-68.2077337 1, 1997. Ломако Ю.В. Специфическая профилактика колибактериоза телят на основе адгезивных антигенов возбудителя. Автореф. дис.канд. вет. наук. - Мн.,2003. - С. 10-13.2077337 1, 1997.0666271 1, 1995.(57) Способ получения фимбриальных адгезинов колибактерий, включающий приготовление суспензии колибактерий, экстракцию адгезинов, их концентрирование и консервирование, отличающийся тем, что экстракцию проводят 0,25-1,0 -ным раствором аммиака при температуре 35-45 С в течение 20-48 ч, концентрирование осуществляют методом разделительной ультрафильтрации, а консервирование - добавлением теотропина в количестве 0,1-0,3 . Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, в частности к производству препаратов для профилактики колибактериоза у животных. Известны способы получения адгезивных антигенов из бактерий 1, 3, 4, 5, 6. Наиболее близким в техническом отношении к предлагаемому изобретению является способ получения фимбриальных адгезинов из возбудителя Е.2. Согласно данному методу, культуру Е.после оптимального роста на бульоне Хоттингера осаждали при 3000 тыс. об./мин, надосадок сливали, а осадок ресуспендировали в 0,2 -ном гидроксиламинно-фосфатном буфере, концентрацию клеток доводили до 40-50 млрд. микробных тел в см 3, прогревали при температуре 70 С в течение 20 мин и центрифугировали при 10 тыс. об./мин в течение 20 мин. Надосадок сливали и использовали как источник фимбриальных антигенов. Для устранения токсичности нативных фимбриальных антигенов добавляли от 0,1 до 0,5 об.формалина (содержание 37-39 формальдегида), смесь выдерживали в термостате при температуре 37 С в течение 24 часов. 10823 1 2008.06.30 Полученные антигены реагировали в реакции диффузной преципитации (РДП) с гомологичными антиадгезивными колисыворотками в титре 18. Недостатком известного способа является низкая биологическая активность целевого продукта. Задача изобретения - повышение биологической активности целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что полученную бактериальную суспензию колибактерий обрабатывают аммиаком, а выделенный фимбриальный адгезин концентрируют методом разделительной ультрафильтрации и консервируют теотропином. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что экстракцию проводят 0,25-1,0 -ным раствором аммиака при температуре 35-45 С в течение 20-48 ч, концентрирование осуществляют методом разделительной ультрафильтрации, а консервирование добавлением теотропина в количестве 0,1-0,3 . Активность фимбриальных адгезинов колибактерий определяли в РДП. Пример 1. Баксуспензию колибактерий, содержащую 100-120 млрд./см 3 микробных тел, экстрагировали 0,25 раствором аммиака в течение 20 ч. Отделенный фимбриальный адгезин концентрировали методом разделительной ультрафильтрации и консервировали теотропином в количестве 0,1 . Активность адгезинов в РДП - 164. Пример 2. То же, что в примере 1, но баксуспензию экстрагировали 0,1 аммиаком в течение 48 часов. Активность адгезинов в РДП составила 18. Пример 3. То же, что в примере 1, но баксуспензию экстрагировали 1,0 аммиаком в течение 48 часов. Активность адгезинов в РДП - 164. Пример 4. То же, что в примере 1, но баксуспензию экстрагировали 1,2 аммиаком в течение 20 часов. Активность адгезинов в РДП составила 132. Пример 5. То же, что в примере 1, но баксуспензию экстрагировали в течение 16 часов. Активность адгезинов в РДП - 132. Пример 6. То же, что в примере 1, но баксуспензию экстрагировали в течение 50 часов. Активность адгезинов в РДП составила 132. Пример 7. То же, что в примере 1, но адгезины консервировали 0,08 теотропином. Адгезины были контаминированы посторонними бактериями и выбракованы. Пример 8. То же, что в примере 1, но адгезины консервировали 0,12 теотропином. Активность адгезинов составила 132. Пример 9 (прототип). Культуру Е.после оптимального роста на бульоне Хоттингера осаждали при 3000 тыс. об./мин, надосадок сливали, а осадок ресуспендировали в 0,2 -ном гидроксиламинно-фосфатном буфере, концентрацию клеток доводили до 40-50 млрд. микробных тел в см 3, прогревали при температуре 70 С в течение 20 мин, центрифугировали при 10 тыс. об./мин в течение 20 мин. Надосадок сливали и использовали как источник фимбриальных антигенов. 2 10823 1 2008.06.30 Фимбриальные антигены консервировали 0,1 -ным формалином. Смесь инкубировали при температуре 37 С в течение 24 ч. Полученный адгезин реагировал в РДП в титре 18. Пример 10 (прототип). То же, что в примере 9, но антиген консервировали 0,5 -ным формалином. Активность адгезинов в РДП - 18. Таким образом, из данных, представленных в примерах, видно, что экстрагирование колибактерий 0,25-1,0 -ным раствором аммиака при температуре 35-45 С в течение 20-48 ч, консервирование отделенного фимбриального адгезина 0,1-0,3 теотропином позволяет получить продукт с активностью в РДП 164, т.е. в 4 раза выше, чем по известному методу (прототипу). Источники информации 1. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. АМН СССР. - М. Медицина,1985. - С. 22-78. 2. Ломако Ю.В. Получение протективных антигенов на основе фимбриальных адгезинов и исследование их свойств. Уч. записки ВГАВМ. - Витебск, 2002. - Т. 38, ч. 1. - С. 66-68. 3. Ломако Ю.В. Специфическая профилактика колибактериоза телят на основе адгезивных антигенов возбудителя Автореф. дис.канд. вет. наук. - Мн., 2003. - С. 10-12. 4. Овод В.В., Вершигора А.Е. Адгезивность бактерий. Успехи современной биологии. 1982. - Т. 94. - С. 213-224. 5.2077377 С 1, 1997. 6. ЕР 0666271 А 1, 1995. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3