Аллерген для диагностики туберкулеза и способ его получения

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АЛЛЕРГЕН ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(72) Авторы Лысенко Александр Павлович Агеева Тамара Николаевна Лемиш Артем Петрович Притыченко Андрей Николаевич Красникова Елена Леонидовна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(56)2045959 С 1, 1995.а 20021129, 2004.а 20031078, 2005.2095816 С 1, 1997. ЛЫСЕНКО А.П. Антигеныи атипичных микобактерий,изучение и применение для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота Автореф. дис. - Мн., 1994. - С. 6, 13, 31.(57) 1. Аллерген для диагностики туберкулеза, полученный из культурального фильтрата штамма 8, отличающийся тем, что молекулярная масса входящих в его состав туберкулопротеинов составляет от 10 до не более 300 кДа. 2. Способ получения аллергена для диагностики туберкулеза из культурального фильтрата штамма 8, включающий выращивание штамма на синтетической питательной среде, инактивацию автоклавированием, отделение культурального фильтрата, его ультрафильтрацию и концентрирование, отличающийся тем, что сначала проводят ультрафильтрацию через мембрану с пределом задержания соединений с молекулярной массой 300 кДа и более и ретентат, объем которого не превышает 1/20 объема культурального фильтрата, отбрасывают, а затем ультрафильтрацию с концентрированием через мембрану с пределом задержания соединений с молекулярной массой 10 кДа и фильтрат отбрасывают. Изобретение относится к иммунологии, в частности к получению биологического препарата для аллергической диагностики туберкулеза. В мировой практике для этой цели широко применяют очищенный аллерген (туберкулин), представляющий собой белок, выделенный химическим путем из культурального фильтрата возбудителя туберкулеза, выращенного на синтетической питательной среде 1, 2. Белок из культурального фильтрата осаждают трихлоруксусной кислотой, сернокислым аммонием и другими химическими веществами с последующим переосаждением и 11119 1 2008.10.30 очисткой спиртом и ацетоном. Такой туберкулин представляет смесь фракций разной молекулярной массы, причем значительная концентрация высокомолекулярных антигенов снижает видовую специфичность препарата, что усложняет диагностику туберкулеза и требует применения дополнительных дифференциальных тестов 3. Процесс производстватуберкулина не исключает контаминацию целевого продукта микрофлорой и накопление протеолитических ферментов, снижающих его активность и специфичность (6). На технологических этапах теряется до 80 белка, в том числе при осаждении трихлоруксусной кислотой до 42 , сульфатом аммония до 30 ,при диализе до 4(5, 6, 7). Применение для осаждения агрессивных химических веществ, сбрасываемых в канализацию, загрязняет окружающую среду. Известно применение способа ультрафильтрации в сочетании с химическим осаждением для получения очищенных препаратов туберкулина и его концентрирования (7). Однако они достоверно не обеспечивают высокий выход специфичных туберкулопротеинов и требуют существенных затрат труда и дорогостоящих реактивов. В значительной степени указанных недостатков лишен аллерген для диагностики туберкулеза, полученный из культурального фильтрата штамма 8 с молекулярной массой 15-100 кДа, что обусловлено очисткой ультрафильтрацией на мембранах с задерживающей способностью 15-100 кДа и активностью в аллергическом тесте 5000010000 /мл или 2500 /мг белка 4, и способ его получения, включающий выращивание штамма на синтетической питательной среде, автоклавирование, стерилизующую фильтрацию и ультрафильтрацию для выделения целевого продукта с использованием мембран (пластинчатые, рулонные или в виде полых волокон) с задерживающей способностью 100 и 15 кДа. После фильтрации через мембраны 100 кДа концентрат отбрасывают. Фильтрат концентрируют на мембранах с пределом задержания 15 кДа и используют в качестве целевого продукта (патент Российской Федерации 2045959) 4. Этот аллерген обладает недостатком, заключающимся в том, что в нем нет недостающих компонентов, молекулярная масса которых находится в пределах до 300 кДа. И поэтому способность данного аллергена выявлять инфицированных возбудителем туберкулеза животных значительно ниже. Данный способ обладает недостатком, заключающимся в том, что из-за удаления молекул с массой более 100 кДа теряется фракция, обладающая высокой специфической активностью, что снижает выход аллергена и повышает его стоимость. Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, является повышение выхода и специфической активности туберкулина, получаемого с помощью ультрафильтрации,снижение его стоимости. Поставленная задача достигается тем, что в аллергене для диагностики туберкулеза,полученном из культурального фильтрата штамма 8, молекулярная масса входящих в его состав туберкулопротеинов составляет от 10 до не более 300 кДа, а в способе получения аллергена для диагностики туберкулеза из культурального фильтрата штамма 8, включающем выращивание штамма на синтетической питательной среде, инактивацию автоклавированием, отделение культурального фильтрата,его ультрафильтрацию и концентрирование, сначала проводят ультрафильтрацию через мембрану с пределом задержания соединений с молекулярной массой 300 кДа и более и ретентант, объем которого не превышает 1/20 объема культурального фильтрата, отбрасывают, а затем ультрафильтрацию с концентрированием через мембрану с пределом задержания соединений с молекулярной массой 10 кДа и фильтрат отбрасывают. Пример 1. Для изготовления аллергена туберкулина очищенного для млекопитающих 8 выращивают при 37 С в течение 8 недель на синтетической питательной среде, инактивируют автоклавированием при 121 С 30 мин. Бактериальную культуральную массу отделяют фильтрацией через грубый и стерилизующий фильтр. 2 11119 1 2008.10.30 Культуральный фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембраны, например РТМК 300 К (РТМКОМР 04) с задерживающей способностью 300 кДа и более до уменьшения объема ретентата (задерживаемой фракции Р 300) не более чем в 15-20 раз. Ретентат отбрасывают. Полученный фильтрат Ф 300 (целевой продукт) собирают, в стерильных условиях доводят содержание туберкулопротеинов до 0,30,09 мг/мл (при изготовлении туберкулина с активностью 25000 МЕ/мл), добавляют фенол, глицерин и твин 80 до достижения массовой доли соответственно 0,5 , 10 и 0,001 . Для изготовления туберкулина с активностью 50000 МЕ/мл фильтрат концентрируют на мембранах с пределом задержания 10 кДа до достижения концентрации туберкулопротеинов 0,60,18 мг/мл,добавляют фенол, глицерин и твин 80 (соответственно 0,5 , 10 и 0,001 ) и фильтрат отбрасывают. Полученный образец с концентрацией белка 0,66 мг/мл (серия 1-00) проверен на активность в соответствии с ГОСТ 16739-88 Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих в сравнении с референтной серией ППД туберкулинадля млекопитающих сер. 02796/2 и ППД туберкулина для млекопитающих Курской биофабрики на морских свинках и крупном рогатом скоте (табл. 1 и 2). Таблица 1 Результаты определения активности очищенного туберкулина серии 1-00 на морских свинках, сенсибилизированных-1 Диаметр эритем, мм Номера Стандартный раствор ППД туберкулина Испытуемая серия 1-00 животныхсер. 02796/2 (контроль) 100101 разв. 2 разв. 1 9 9,5 9 6 2 15 8 16 9 3 13 7 14 11 4 12 11 13 10 5 10 6,5 11 7 6 8 6,5 9 5 7 9 5 9 5 8 12 7,5 9 8 Сумма диаметров 149 151 Активность испытуемой серии 151149 х 50 000 МЕ 50650 МЕ в 1 мл. Таблица 2 Сравнение интенсивности кожных реакций на введение контрольной серии ППД туберкулина для млекопитающих и туберкулина очищенного (целевой продукт) крупному рогатому скоту, сенсибилизированному-1 Утолщение кожных складок, мм ОценкаживотДоза интенсивности Контрольная серия 20 ППД ного Целевой продукт реакции туберкулина 3685 5000 МЕ 6-14 6-15 11119 1 2008.10.30 В 4 случаях реакция на контрольную серию были интенсивнее, в 4 случаях менее интенсивными, чем на целевой продукт, что указывает на их равную аллергическую активность. Пример 2. Для изучения специфичности туберкулина очищенного (целевой продукт) проведено испытание в сравнении с ППД туберкулином серии 11 Курской биофабрики в длительно благополучном по туберкулезу стаде. Из 102 коров на введенные препараты реагировало 6 (табл. 3). Таблица 3 Сравнение специфичности целевого продукта и ППД туберкулина Курской биофабрики в длительно благополучном по туберкулезу стаде Утолщения кожных складок в мм до и после введения аллергенов, кличка ППД туберкулин Курской био- Туберкулин очищенный (целевой фабрики сер. 11 5000 МЕ продукт) 5000 МЕ Мечта 6-93 6-82 3167 5-105 5-94 Фея 6-126 6-126 Лада 5-94 5-83 7929 6-104 6-82 Как видно из табл. 3, 5 коров реагировали на ППД туберкулин Курской биофабрики и только 3 коровы реагировали на целевой продукт, что указывает на его большую специфичность (на 40 ). Пример 3. Для оценки эффективности очистки с помощью ультрафильтрации на мембранах с пределом задержания 300 кДа исследуют фракции в иммуноферментном анализе(ИФА) и в кожной пробе на морских свинках. В ИФА (табл. 4) определили индекс специфической и перекрестной активности фракций, полученных при различных режимах ультрафильтрации. Контролем служили исходный культуральный фильтрат и ППД туберкулин. Препараты в равных по белку дозах фиксировали в одинаковых условиях на одной иммунологической панели. ИФА ставят в непрямом варианте, с использованием референтных бычьих антисывороток к .и к смеси атипичных микобактерий 2-4 группы по Раньону. В качестве конъюгата использовали кроличьиккрупного рогатого скота, меченные пероксидазой, например . Таблица 4 Специфическая активность фракций, получаемых при ультрафильтрации Стандартный Культуральный Р 300 (отбрасывае- Ф 300 (целевой раствор ППД Показатели фильтрат (исходмая фракция) продукт) туберкулина ный продукт)(контроль) Индекс специфической активно 2,7 1,6 2,6 3,4 сти Индекс перекре 6,5 9,1 4,9 4,4 стной активности- различия статистически достоверны. Как видно из таблицы 4, специфическая активность у Р 300 (удаляемой фракции) была достоверно ниже, а перекрестная активность достоверно выше, чем у исходного и контрольного препарата. Благодаря удалению этой фракции перекрестная активность целевого продукта снижалась с 6,5 до 4,9 (на 24,6 ) и достоверно не отличалась от показателя ППД туберкулина (4,4). 11119 1 2008.10.30 Для сравнения эффективности очистки по прототипу (табл. 5) часть культурального фильтрата подвергали ультрафильтрации через мембраны с задерживающей способностью 100 и 15 кДа и получали ретентат Р 100 и фильтрат Ф 100, который концентрировали на мембранах с пределом задержания 15 кДа (целевой продукт по прототипу). Таблица 5 Результаты изучения в ИФА эффективности очистки по прототипу Индекс специфической Показатель перекрестПрепараты активности ной активности ППД туберкулин (контроль) 1,6 4,0 Исходный автоклавированный культу 1,3 4,2 ральный фильтрат Р 100 (удаляемая фракция) 1,3 3,1 Ф 100 (целевой продукт по прототипу) 1,3 3,4 Как видно из табл. 5, очистка по прототипу снижала перекрестную активность целевого продукта с 4,2 до 3,4 (на 19 ). Но одинаковый индекс специфической активности у удаляемой фракции и целевого продукта указывал на потерю специфических антигенов. Это подтверждают и результаты изучения фракций на морских свинках, сенсибилизированных . -1 и смесью атипичных микобактерий 2-4 группы по Раньону(табл. 6). Таблица 6 Диаметры эритемы на препараты в дозе, эквивалентной по белку 125 ,у морских свинок, сенсибилизированных микобактериями разных видов (мм) Вид мико- ППД туберкуИсходный культуральный Р 100 Ф 100 бактерий лина (контроль) фильтрат БЦЖ 10,40,4 9,31,1 8,90,7 7,70,7 16,40,4 7,10,5 6,80,5 5,70,5 Как видно из табл. 6, у морских свинок, сенсибилизированных микобактериями бычьего вида (БЦЖ), активность Ф 100 была меньше, чем у ППД туберкулина и исходного фильтрата. Пример 4. После выращивания производственного штамма возбудителя туберкулеза,автоклавирования и фильтрации культуральной жидкости получено 10 л культурального фильтрата с содержанием туберкулопротеинов 0,25 мг/мл или 2500 мг во всем объеме. 10 л культурального фильтрата подвергли ультрафильтрации через мембраны РТМК 300 К (РТМКОМР 04). При этом было получено 500 мл ретентата (удаляемой фракции) и 9500 фильтрата. Содержание туберкулопротеинов в ретентате составило 0,6 мг/мл или 300 мг в общем объеме. Полученный фильтрат (9500 мл) содержал 2200 мг туберкулопротеинов (0,23 мг/мл). Фильтрат (9500 мл) подвергли концентрации на мембранах( 04) с пределом задержания 10 кДа до объема 3166 мл (в 3 раза). В полученном концентрате содержание туберкулопротеинов составило 0,66 мг/мл (общее - 2089 мг). Активность 1 мл полученного продукта составила 50650 , в пересчете на 1 мг туберкулопротеинов - 76742 . При получении целевого продукта по прототипу активность 1 мл продукта составляет 49500-50000 , а 1 мг туберкулопротеинов - 49750 . Следовательно, выход целевого продукта по заявляемому решению на 35,1 выше. Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет добиться увеличения выхода целевого продукта, увеличения его специфичности, активности, а также снижения его стоимости за счет того, что культуральный фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембраны с пределом задержания 300 кДа, фильтрат собирают до уменьшения объема ретентата (задерживаемой фракции) не более чем в 15- 20 раз., . . - 1934. - . 30. -6. - . 713-720. 2. Линникова М.А. Очищенный протеинодериват туберкулина. Проблемы туберкулеза. - М., 1939. -12. 3. Лысенко А.П. Антигеныи атипичных микобактерий, изучение и применение для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота Автореф. дисс. докт. вет. наук. - Мн., 1994. - 35 с. 4. Патент 2045959, МПК 6 А 61 39/04, 39/35, 1995 (прототип). 5. Петров Р.В. Иммунология. - М. Медицина, 1983. - С. 368 6. Безгин В.М. Совершенствование промышленной технологии (ППД) туберкулина и его биохимическая характеристика Автореф. дисс. канд. биол. наук. - М., 1990. - С. 27. 7. Шевырев Н.С. Совершенствование промышленной технологии сухого очищенного туберкулина для млекопитающих. Тр. ВГНКИ. ветпрепаратов. - М., 1972. Т. . - . 37. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6