Способ получения гипериммунных сывороток против бактериальных и вирусных инфекций

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ(71) Заявители Зайцев Владимир Владимирович Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Алеся Владимировна Зайцева Виктория Владимировна(72) Авторы Зайцев Владимир Владимирович Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Алеся Владимировна Зайцева Виктория Владимировна(73) Патентообладатели Зайцев Владимир Владимирович Дремач Геннадий Эдуардович Зайцева Алеся Владимировна Зайцева Виктория Владимировна(56) Руководство по вакцинному и сывороточному делу. - М., Медицина, 1978. С. 296-297.2062617 1, 1996.1101235 , 1984.1793929 3, 1993.2050858 1, 1995.2174408 2, 2001.2199343 1, 2003.1362478 1, 1987.2158137 1, 2000.(57) Способ получения гипериммунной сыворотки против сальмонеллеза, или колибактериоза, или пастереллеза, или стрептококкоза, или лептоспироза, или ротавирусной и коронавирусной инфекций животных, или гемофилезного полисерозита, или актинобациллярной (гемофилезной) плевропневмонии, или рожи свиней, или парагриппа-3, вирусной диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, при котором получают соответствующие антигены, проводят иммунизацию волов-продуцентов или бычков на откорме, получают сыворотку из крови иммунизированных животных, очищают ее от крупномолекулярных балластных компонентов путем отработки при температуре 37-50 С в присутствии 0,4-0,6 хлороформа и 0,05-0,10 фермента алкалазы в течение 1-2 часов,отстаивают при температуре 2-15 С в течение 5-60 суток, сыворотку декантируют, подвергают ультрафильтрации через мембраны с порогом задержания 200-300 КД, очищают от низкомолекулярных балластных компонентов и концентрируют путем ультрафильтрации через мембраны с порогом задержания 20 КД, в очищенную сыворотку добавляют глюкозу или мальтозу в количестве 4-10 и теотропин в количестве 0,1-0,3 от объема. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к производству гипериммунной сыворотки, используемой для лечения и профилактики сальмонеллеза,или колибактериоза, или пастереллеза, или стрептококкоза, или лептоспироза, или ротавирусной и коронавирусной инфекции животных, или гемофилезного полисерозита, или актинобациллярной (гемофилезной) плевропневмонии, или рожи свиней, или парагриппа-3,вирусной диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. 12963 1 2010.02.28 Известны способы получения гипериммунных сывороток, предусматривающие приготовление антигена, иммунизацию продуцентов и получение сыворотки 1, 2. Наиболее близким в техническом отношении к предлагаемому изобретению является способ получения сыворотки, предусматривающий ее ферментацию пепсином, термоденатурацию в течение 45 минут при рН 4,3, температуре 58 С в присутствии 14-14,5 сульфата аммония. Активные глобулины концентрируют путем высаливания сульфатом аммония в концентрации 34 от объема при рН 7,1. Высаленный активный глобулин диализируют и дополнительно очищают от балластных белков в их изоэлектрической точке при рН 5,2-5,6, консервируют хлороформом 3. Указанный метод не обеспечивает полного удаления балластных сывороточных белков. Потери активных белковых глобулинов на стадиях технологического процесса составляют свыше 60-70 . Таким образом, известный способ имеет ряд существенных недостатков выраженная анафилактогенность, низкая стабильность и выход целевого продукта. Задача изобретения - улучшение качественных характеристик сывороток путем сохранения их нативности, стабильности, повышения биологической активности и снижения анафилактогенности. Поставленная цель достигается тем, что сыворотку очищают от крупно- и низкомолекулярных компонентов, концентрируют, стабилизируют добавлением глюкозы или мальтозы до концентрации 4-5 , консервируют теотропином в концентрации 0,1-0,3 от объема. Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что для приготовления гипериммунной сыворотки против сальмонеллеза, или колибактериоза, или пастереллеза, или стрептококкоза, или лептоспироза, или ротавирусной и коронавирусной инфекций животных, или гемофилезного полисерозита, или актинобациллярной (гемофилезной) плевропневмонии, или рожи свиней, или парагриппа-3, вирусной диареи и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота получают соответствующие антигены, проводят иммунизацию волов-продуцентов или бычков на откорме, получают сыворотку из крови иммунизированных животных, очищают ее от крупномолекулярных балластных компонентов путем отработки при температуре 37-50 С в присутствии 0,4-0,6 хлороформа и 0,05-0,10 фермента алкалазы в течение 1-2 часов, отстаивают при температуре 2-15 С в течение 5-60 суток, сыворотку декантируют, подвергают ультрафильтрации через мембраны с порогом задержания 200-300 КД, очищают от низкомолекулярных балластных компонентов и концентрируют путем ультрафильтрации через мембраны с порогом задержания 20 КД, в очищенную сыворотку добавляют глюкозу или мальтозу в количестве 4-10 и теотропин в количестве 0,1-0,3 от объема. Вносимые стабилизаторы должны обладать определенными качественными характеристиками помимо главного - обеспечения стабильности препаратов во время получения и последующего хранения, не нести антигенности, не вносить, по возможности, новой специфической биологической активности, быть доступными по стоимости. Стабилизатор должен обеспечивать определенную физическую стабильность молекул иммуноглобулина в изоэлектрической точке, сохранение -опосредованных функций. Тест на термостабильность, который является аналогом условий хранения, осуществляли путем прогрева стерильного раствора иммуноглобулина в течение 24 часов при температуре 57 С. Содержание и распределение классов и субклассов иммуноглобулинов контролировали методом иммуноэлектрофореза и иммуноферментного анализа. Пример 1 (прототип). Полученную из крови сыворотку ферментируют пепсином в течение 1 часа при рН 3,2 и 1 часа при рН 4,2 при 22-24 С. Ферментированную сыворотку термоденатурируют в течение 45 минут при рН 4,3, температуре 58 С в присутствии 14-14,5 сульфата аммония. После термоденатурации активные глобулины высаливают сульфатом аммония в концентрации 34 от объема при рН 7,1. Высаленный активный глобулин диализируют и дополнительно очищают от балластных белков в их изоэлектрической точке при рН 5,2-5,6,2 12963 1 2010.02.28 консервируют хлороформом. Для стабилизации свойств очищенные сыворотки выдерживают в течение 3 месяцев, после чего, в случае необходимости, подвергают повторной фильтрации. Выход целевого продукта составляет 30-40 , а анафилактогенность - 24,8 . Пример 2. Сыворотку против сальмонеллеза животных очищают от крупномолекулярных балластных компонентов путем ее отработки при температуре 37 С в течение 2 часов в присутствии 0,4 хлороформа и 0,05 фермента алкалазы, отстаивают в течение 5 суток при температуре 2-15 С, декантируют надосадок и ультрафильтруют через мембраны с порогом задержания 200 КД. Далее сыворотку очищают от низкомолекулярных компонентов и одновременно концентрируют путем ультрафильтрации через мембрану с порогом задержания 20 КД. Очищенную сыворотку стабилизируют добавлением глюкозы в количестве 4 и консервируют теотропином в концентрации 0,1 от объема. Активность специфических иммуноглобулинов сохранялась на 95,6 , анафилактогенность составила 3,6 . Пример 3. Сыворотку против колибактериоза животных очищают от крупномолекулярных балластных компонентов путем ее отработки при температуре 50 С в течение 1 часа в присутствии 0,6 хлороформа и 0,1 фермента алкалазы, отстаивают в течение 60 суток при температуре 15 С, а декантированный надосадок ультрафильтруют через мембраны с порогом задержания 300 КД. От низкомолекулярных компонентов сыворотку очищают с последующей концентрацией биологически активной фракции путем ультрафильтрации через мембрану с порогом задержания 20 КД. Очищенную сыворотку стабилизируют добавлением глюкозы в количестве 10 и консервируют теотропином в концентрации 0,3 от объема. Активность специфических иммуноглобулинов сохранялась на 94,2 , анафилактогенность составила 3,2 . Пример 4. Тоже, что в примере 2, но очищают, концентрируют, фильтруют, стабилизируют и консервируют сыворотку против рожи свиней. Активность специфических иммуноглобулинов сохранялась на 93,2 , анафилактогенность составила 3,8 . Пример 5. То же, что в примере 2, но очищают, концентрируют, фильтруют, стабилизируют и консервируют сыворотку против гемофилезного полисерозита или актинобациллярной(гемофилезной) плевропневмонии свиней. Активность специфических иммуноглобулинов составила 93,8 . Пример 6. То же, что в примере 3, но очищают, концентрируют, фильтруют, стабилизируют и консервируют сыворотку против ротавирусной и коронавирусной инфекции животных. Активность специфических иммуноглобулинов составила 94,5 . Пример 7. То же, что в примере 3, но очищают, концентрируют, фильтруют, стабилизируют и консервируют сыворотку против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота. Активность специфических иммуноглобулинов составила 93,5 , анафилактогенность - 3,8 . Пример 8. То же, что в примере 3, но очищают, концентрируют, фильтруют, стабилизируют и консервируют сыворотку против стрептококкоза животных. Активность специфических иммуноглобулинов составила 92,5 , анафилактогенность - 4,2 . Пример 9. То же, что в примере 3, но очищают, концентрируют, фильтруют, стабилизируют и консервируют сыворотку против лептоспироза животных. Активность специфических иммуноглобулинов составила 93,4 , анафилактогенность - 4,8 . 3 12963 1 2010.02.28 Пример 10. То же, что в примере 2, но сыворотку против сальмонеллеза животных очищают путем ультрафильтрации с порогом задержания 100 КД, а концентрируют методом ультрафильтрации с порогом задержания 20 КД. Стабилизируют сыворотку путем добавления глюкозы в количестве 3 и консервируют теотропином в концентрации 0,08 от объема. Сыворотка при таких технологических параметрах не очищалась от прионных и вирусных инфекций, поэтому сыворотка неприемлема для применения. Активность специфических иммуноглобулинов составила 34,2 , анафилактогенность - 12,8 . Пример 11. То же, что в примере 2, но сыворотку против сальмонеллеза животных очищают путем микрофильтрации через мембрану с величиной пор 0,1 мкм, а концентрируют методом ультрафильтрации с порогом задержания 50 КД. Стабилизируют сыворотку добавлением до 6 глюкозы, а консервируют теотропином в концентрации 0,4 . Активность специфических иммуноглобулинов составила 88,2 , анафилактогенность 18,8 . Более того, в процессе хранения сыворотки отмечалась агрегация и выпадение в виде осадка специфических иммуноглобулинов. Пример 12. То же, что в примере 2, но сыворотку против сальмонеллеза животных стабилизируют путем добавления мальтозы в количестве 10 . Активность специфических иммуноглобулинов составила 93,8 , анафилактогенность - 3,4 . Пример 13. То же, что в примере 2, но сыворотку против сальмонеллеза животных стабилизируют путем добавления мальтозы в количестве 4 . Активность специфических иммуноглобулинов составила 92,8 , анафилактогенность - 3,1 . Из представленных результатов видно, что стабилизаторы мальтоза и глюкоза в концентрации 4-10 и консервант теотропин в концентрации 0,1-0,3 способствуют сохранению нативности сывороток и препятствуют агрегации и фрагментации специфических глобулинов во время получения и хранения. Сахара улучшают переносимость (толерантность) сыворотки, снижают частоту побочных реакций с 18,8 до 3,1-4,8 , а также улучшают качественные характеристики сыворотки в тесте термостабильности, обеспечивая наибольшую прозрачность и стабильность. Использование в процессе очистки и концентрирования сывороток метода ультрафильтрации с порогом задержания от 20 до 300 КД, их стабилизация мальтозой или глюкозой в концентрации 4-10 и консервация теотропином в концентрации 0,1-0,3 от объема позволяют повысить выход целевого продукта с 34,2 до 92,5-95,6(примеры 2-9, 12-13). Источники информации 1. Ветеринарные препараты справочник / Под ред Д.Ф. Осидзе. - М. Колос, 1981. - 448 с. 2. Медведев А.П., Вербицкий А.А. Противобактериальные гипериммунные сыворотки монография. - Витебск, 2001. - 121 с. 3. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / Под ред. П.Н. Бургасова. - М. Медицина, 1978. - С. 296-297 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4