Иммуномодулирующее средство

(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Бизунок Наталья Анатольевна Дубовик Борис Валентинович Шадыро Олег Иосифович Полозов Генрих Иванович(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет в качестве иммуномодулирующего средства. Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, гематологии, фармакологии, фармации, и может быть использовано в лабораторной практике для изучения клеточных механизмов иммунитета, а также для разработки нового лекарственного средства иммуномодулирующего типа действия. Способность фагоцитов продуцировать и выделять в окружающую среду активные формы кислорода (АФК) называется оксидантным (окислительным) взрывом 1. Это явление имеет важное биологическое значение для нормального функционирования иммунитета, поскольку обеспечивает разрушение фагоцитированных чужеродных объектов. Недостаточность ферментов, ответственных за реализацию оксидантного взрыва, приводит к тяжелому заболеванию - хронической гранулематозной болезни 2, 3. В то же время избыточная продукция АФК фагоцитами является одной из причин многих патологических состояний, включая ишемическо-реперфузионные повреждения миокарда, атеро 16942 1 2013.04.30 склероз, гепатиты и циррозы печени, хронические артриты (в том числе подагрический),хронические воспалительные заболевания легких и реакцию отторжения трансплантата 4. В связи с этим поиск веществ, способных подавлять оксидантный взрыв фагоцитов и посредством этого оказывать лечебный эффект, является актуальным направлением работ в области иммунофармакологии. Иммуномодуляция (иммунокоррекция) - исправление дефектного функционирования иммунной системы, проявляющееся в усилении ослабленного или торможении стимулированного звена иммунитета 5. В соответствии с международной анатомотерапевтическо-химической (АТХ) классификацией лекарственных средств к иммуномодуляторам относят прежде всего лекарственные средства, входящие в группу- противоопухолевые препараты и иммуномодуляторы, а также 01 - противовоспалительные и противоревматические препараты, 06 - антигистаминные препараты для системного применения, АН - витамины и отдельные средства других групп 6. Известны иммуномодуляторы, подавляющие оксидантные функции фагоцитов аскорбиновая кислота 7, 8, альфа-токоферол 8, 9, 10, колхицин 11, 12, 13, препараты эхинацеи,циклоспорин, микофеноловая кислота, цитостатики, глюкокортикостероиды и др. 6. Наиболее известные из них - альфа-токоферол и аскорбиновая кислота - в терапевтическом диапазоне концентраций не обладают высокой эффективностью в отношении оксидантного взрыва фагоцитов. Более того, в высоких дозах эти лекарственные средства могут усугублять оксидантные повреждения при их изолированном применении. Препараты эхинацеи содержат комплекс действующих веществ, индивидуальный вклад каждого из которых в результирующий эффект недостаточно изучен, кроме того,препараты эхинацеи трудно стандартизировать, они относительно мало эффективны как модуляторы функции фагоцитов. Циклоспорин и микофеноловая кислота, а также цитостатики и глюкокортикостероиды опосредованно влияют на функции фагоцитов через регуляцию их взаимодействия с лимфоцитами. Они высокотоксичны, обладают широким спектром побочных эффектов и противопоказаний к применению, дорогостоящи. В качестве прототипа избран колхицин, который используется для лечения подагры из-за выраженного подавляющего влияния на функции фагоцитов - макрофагов и нейтрофилов 13. К недостаткам прототипа относятся сложность получения, высокая стоимость, высокая токсичность, обусловленная подавлением клеточного деления, с клиническими проявлениями нарушения системы кроветворения, репродуктивной функции, регенерации эпителия желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, кожного эпидермиса 5, 6. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств иммуномодулирующего типа действия, обладающих при этом низкой токсичностью. Поставленная задача достигается применением для подавления функции фагоцитов(окислительного взрыва) ранее известного соединения 3-(2-гидроксиэтилтио)-4,6-ди-третбутилпирокатехина формулы 16942 1 2013.04.30 Заявляемое соединение 3-(2-гидроксиэтилтио)-4,6-ди-трет-бутилпирокатехин описано в литературе 14. Авторами обнаружены неочевидные свойства данного соединения, позволяющие применять его в качестве иммуномодулятора, подавляющего функцию фагоцитарных клеток, связанную с оксидантным взрывом и массивной продукцией активных форм кислорода (АФК). Среди иммуномодуляторов, применяемых в клинической практике, нами не обнаружено структурных аналогов заявляемого соединения. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Влияние заявляемого вещества на окислительный взрыв фагоцитов в перитонеальных макрофагах крыс. Генерируемые макрофагами при окислительном взрыве АФК регистрируют методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре 1251 (Финляндия). Исследование начинают через 10 мин после внесения соединения 1 в кювету люминометра (10-9-10-4 моль/л), содержащую 106 жизнеспособных макрофагов в среде Хенкса, люминол (710-5 моль/л), индуктор окислительного взрыва фагоцитов - опсонизированный зимозан 15 - в количестве 5107 частиц. Объем пробы составляет 1 мл, средой является раствор Хенкса без индикатора. Аналогичным образом изучают действие прототипа (колхицин) и аналога (альфа-токоферол) (диапазон изучаемых концентраций составляет 10-9-10-4 моль/л). Влияние соединений на жизнеспособность макрофагов оценивают в тесте с трипановым синим (0,1 ) 16. Регистрацию ЛХЛ проводят при 37 С на протяжении 40 мин. Количественную оценку образования АФК осуществляют по площади под кривой ЛХЛ ( ХЛ, мВ). Показатели ЛХЛ проб, содержащих соединение 1, выражают вк контрольным значениям (без 1). Статистическую обработку результатов проводят с использованием парного-критерия, различия считают достоверными при вероятности ошибки 5(табл. 1). Активность соединения 1 и препаратов сравнения оценивают по степени подавления ХЛ, вычисляя эффективные ингибирующие концентрации (16-84 методом регрессионного анализа с использованием программного пакета 6,1 (табл. 2). Таблица 1 Сравнительная эффективность заявляемого вещества (соединения 1), аналога(альфа-токоферола) и прототипа (колхицина) в отношении окислительного взрыва макрофагов (по критериюХЛ) Вещества, шифр-91,81,3 Примечание к табл. 1- максимальная эффективная концентрация,- максимальный эффект подавления ХЛ , указано средне значение и ошибка среднего.0,01 в сравнении с колхицином и альфа-токоферолом по парному -критерию(двусторонний вариант). По результатам теста с трипановым синим (0,1 ), соединение 1 не оказывает токсического действия на макрофаги во всем изученном диапазоне концентраций (10-9-10-4 моль/л). Как видно из табл. 1, соединение 1 полностью подавляет оксидантный взрыв макрофагов, превосходя по максимальной эффективностиоба препарата сравнения. Сравнительное изучение активности показало, что диапазон эффективных концентраций (1684) для заявляемого соединения существенно шире и находится в области более низких концентраций, чем для препаратов сравнения (табл. 2). По критериям 16-84 активность 16942 1 2013.04.30 соединения 1 превышает активность альфа-токоферола от 4000 до 40 раз колхицина - от 13000 до 37 раз в биологически приемлемом диапазоне концентраций. Таблица 2 Эффективные ингибирующие концентрации заявляемого вещества (соединения 1), аналога (альфа-токоферола) и прототипа (колхицина) на окислительный взрыв макрофагов (16-84, мкмоль/л по критериюХЛ) Название 16 С 30 С 50 С 70 84 0,0001-0,0002 0,008-0,02 0,7-1,7 50,9-122,0 Примечание к табл. 2 Указано среднее значениеи 95 доверительный интервал.0,001 в сравнении с колхицином и альфа-токоферолом. Пример 2. Влияние заявляемого вещества на эффект альфа-фактора некроза опухоли (ФНО-) в отношении окислительного взрыва фагоцитов в перитонеальных макрофагах крыс. Генерируемые макрофагами при окислительном взрыве АФК регистрируют методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре 1251 (Финляндия). К жизнеспособным макрофагам, суспендированным в среде Хенкса с добавлением 10 эмбриональной сыворотки телят (106 клеток/мл), вносят соединение 1 в диапазоне концентраций 10-10-10-4, а через 10 мин - ФНО- (, Германия) в максимально эффективной концентрации -10,0 нг/мл, установленной предварительно. Суспензию инкубируют 30 мин при 38 С, затем к клеткам добавляют люминол (710-5 моль/л) и индуктор окислительного взрыва фагоцитов - опсонизированный зимозан 15 - в количестве 5107 частиц. Объем пробы составляет 1 мл. Аналогичным образом изучают действие прототипа (колхицин), диапазон изучаемых концентраций составляет 10-9-10-4 моль/л. Регистрацию ЛХЛ проводят при 38 С на протяжении 40 мин. Количественную оценку образования АФК осуществляют по площади под кривой ЛХЛ ( ХЛ, мВ). Показатели ЛХЛ проб, содержащих соединение 1, выражают вк контрольным значениям (без 1). Статистическую обработку результатов проводят с использованием парного -критерия, различия считают достоверными при вероятности ошибки 5(табл. 3). Активность соединения 1 и препаратов сравнения оценивают по степени подавления ХЛ, вычисляя эффективные ингибирующие концентрации (16-84) методом регрессионного анализа с использованием программного пакета 6,1 (табл. 4). Таблица 3 Сравнительная эффективность заявляемого вещества (соединения 1) и прототипа (колхицина) в отношении стимулирующего действия ФНО на окислительный взрыв макрофагов (по критериюХЛ)-91,81,3 10 10 мкг/л ФНО 165,59,7 7 100 мкмоль/л 10 мкг/л КолхицинФНО 7,86,7 8 100 мкмоль/л 10 мкг/л 1 ФНО-73,86,3 Примечание к табл. 3- максимальная эффективная концентрациямаксимальный эффект в сравнении с контролем , указано средне значениеошибка 4 16942 1 2013.04.30 среднего- число опытов 0,01 в сравнении с контролем,0,05 в сравнении с эффектом колхицина в присутствии ФНО- - по парному -критерию (двусторонний вариант). Как видно из табл. 3, ФНО- усиливает генерацию АФК в макрофагах на 166 по сравнению с контролем (в отсутствии модуляторов). Соединение 1 подавляет стимулирующее действие ФНО- и эффективно (на 74 ) снижает продукцию АФК по сравнению с контрольными значениями. Колхицин также блокирует эффект ФНО-, но ингибирующим действием в этом тесте не обладает. По критериям 16-84 активность соединения 1 на фоне стимулирующего действия ФНО- остается высокой, но уступает действию 1 при его отсутствии (табл. 4). Модифицирующее действие 1 в отношении ФНО- - важный биологический эффект, поскольку ФНО- является одним из главных индукторов гипериммунных ответов,сопровождающих воспалительные, аллергические, шоковые реакции и отторжение трансплантата, а активация оксидантного взрыва является ведущим механизмом тканевых повреждений при перечисленных патологических состояниях. Таблица 4 Эффективные ингибирующие концентрации заявляемого вещества (соединения 1) на модели окислительного взрыва макрофагов при изолированном действии и в присутствии ФНО- (16-84, мкмоль/л по критериюХЛ) 0,0010,01 0,010,4 5,614,8 Примечание к табл. 4 указано среднее значениеи 95 доверительный интервал. По результатам изучения токсичности на белых рандомбредных мышах и крысах линии , соединение 1 относится к малотоксичным веществам ( класс опасности). Таким образом, заявляемое соединение позволяет решить поставленную задачу. Применение 3-(2-гидроксиэтилтио)-4,6-ди-трет-бутилпирокатехина приводит к подавлению окислительного взрыва фагоцитов, индуцированного опсонизированными частицами, а также к подавлению стимулирующего действия ФНО- на клеточные механизмы генерации АФК. Оба эффекта свидетельствуют о выраженной активности заявляемого соединения в отношении иммунных механизмов реагирования и повреждения, связанных с активацией фагоцитарных клеток. Заявляемое соединение может быть непосредственно использовано в экспериментально-исследовательской работе для изучения клеточных механизмов иммунной резистентности и АФК-зависимого повреждения биоструктур и разработки нового лекарственного средства после дополнительного доклинического и клинического изучения. Источники информации 1. Земсков В.М., Барсуков А.А., Безносенко С.А. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток). Хаитов Р.М.,Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М. ВНИРО, 1995. - Гл. 6. - С. 154-162. 2. Гомес Л.А., Ярцев М.Н., Барсуков А.А., Присяжнюк В.Л. Хроническая гранулематозная болезнь спектр клинико-лабораторных нарушений, тактика терапии // Педиатрия. 1991. -8. - С. 65-70. 16942 1 2013.04.30 3..// . . . - 1993. - . 67. - . 2-15. 4.,,//. - 2006. - . 111. . 1-20. 5. Клиническая иммунология и аллергология Учебное пособие / од ред. А.В. Караулова. - М. Медицинское информационное агенство, 2002. - 651 с. 6. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Беларуси Справочник. - М. АстраФармСервис, 2007. - 976 с. 7. Патент 005626883, МПК 01 31/02, 1997. 8..,., -,-// .. - 1990. - . 62. - . 27-58. 9. Патент 0077188142, МПК 07 311/00, 07 315/00, 2010. 10..,.,.,,- ( ) // . . . - 1985. - . 37.4. - . 449-459. 11. Клиническая фармакология по Гудману и Гилману / Под общ. ред. А.Г. Гилмана. В 4 т. Книга вторая. - М. Практика, 2006. - С. 557-558. 12.// . . . . - 1974. - . 291. - . 1187 - 1188. 13..,.,.-.//. 1984. - . 257. -3. - Р. 388-99. 14. Масловская Л.А., Петрикевич Д.К., Тимощук В.А., Шадыро О.И. Синтез и антиокислительная активность серосодержащих производных 3,5-ди-трет-бутилпирокатехина Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6