Иммуномодулирующее средство

(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Бизунок Наталья Анатольевна Дубовик Борис Валентинович Шадыро Олег Иосифович Полозов Генрих Иванович(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет в качестве иммуномодулирующего средства. Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, гематологии, фармакологии, фармации, и может быть использовано для разработки нового лекарственного средства иммуномодулирующего типа действия. Способность фагоцитов продуцировать и выделять в окружающую среду активные формы кислорода (АФК) называется оксидантным (окислительным) взрывом 1. Это явление имеет важное биологическое значение для нормального функционирования иммунитета, поскольку обеспечивает разрушение фагоцитированных чужеродных объектов. Недостаточность ферментов, ответственных за реализацию оксидантного взрыва, приводит к тяжелому заболеванию - хронической гранулематозной болезни 2, 3. В то же время избыточная продукция АФК-фагоцитами является одной из причин многих патологических состояний, включая ишемическо-реперфузионные повреждения миокарда, атеросклероз, гепатиты и циррозы печени, хронические артриты (в том числе подагрический),хронические воспалительные заболевания легких и реакцию отторжения трансплантата 4. В связи с этим поиск веществ, способных подавлять оксидантный взрыв фагоцитов и посредством этого оказывать лечебный эффект, является актуальным направлением работы в области иммунофармакологии. Иммуномодуляция (иммунокоррекция) - исправление дефектного функционирования иммунной системы, проявляющееся в усилении ослабленного или торможении стимули 16827 1 2013.02.28 рованного звена иммунитета 5. В соответствии с международной анатомо-терапевтическо-химической (АТХ) классификацией лекарственных средств к иммуномодуляторам относят прежде всего лекарственные средства, входящие в группу- Противоопухолевые препараты и иммуномодуляторы, а также 01 - Противовоспалительные и противоревматические препараты, 06 - Антигистаминные препараты для системного применения,11 - Витамины и отдельные средства других групп 6. Известны иммуномодуляторы, подавляющие оксидантные функции фагоцитов аскорбиновая кислота 7, 8, альфа-токоферол 8, 9, 10, колхицин 11, 12, 13, препараты эхинацеи, циклоспорин, микофеноловая кислота, цитостатики, глюкокортикостероиды и др. 6. Наиболее известные из них - препараты эхинацеи - содержат комплекс действующих веществ, индивидуальный вклад каждого из которых в результирующий эффект недостаточно изучен, кроме того, препараты эхинацеи трудно стандартизировать, они относительно малоэффективны, как модуляторы функции фагоцитов. Циклоспорин и микофеноловая кислота, а также цитостатики и глюкокортикостероиды опосредованно влияют на функции фагоцитов, через регуляцию их взаимодействия с лимфоцитами. Они высоко токсичны, обладают широким спектром побочных эффектов и противопоказаний к применению, дорогостоящи. В качестве прототипа избран альфа-токоферол, который является структурным аналогом заявляемого соединения. К недостаткам прототипа относятся низкая избирательность иммуномодулирующего действия, высокая индивидуальная вариабельность эффективности в терапевтическим диапазоне концентраций, а также трудности в стандартизации готового продукта и токсические риски, обусловленные нарушением оксидантного баланса при изолированном применении. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств иммуномодулирующего типа действия, обладающих при этом низкой токсичностью. Поставленная задача достигается применением для подавления функции фагоцитов(окислительного взрыва) ранее известного соединения 5-метокси-1,3-бензоксатиол-2-она Заявляемое соединение 5-метокси-1,3-бензоксатиол-2-он описано в литературе 14. Авторами обнаружены неочевидные свойства данного соединения, позволяющие применять его в качестве иммуномодулятора, подавляющего функцию фагоцитарных клеток, связанную с оксидантным взрывом и массивной продукцией АФК. Среди известных иммуномодулирующих средств нами не обнаружено соединений подобной химической структуры. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Определение влияния заявляемого вещества на окислительный взрыв фагоцитов в перитонеальных макрофагах крыс. Генерируемые макрофагами при окислительном взрыве АФК регистрируют методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре 1251 (Финляндия). Исследование начинают через 10 минут после внесения соединения С 16 в кювету люминометра (10-9-10-4 моль/л), содержащую 106 жизнеспособных макрофагов в среде Хенкса, люминол (710-5 моль/л), индуктор окислительного взрыва фагоцитов - опсонизированный зимозан 14 - в количестве 5107 частиц. Объем пробы составляет 1 мл, средой является раствор Хенкса без индикатора. Аналогичным образом изучают действие прототипа (альфа-токоферол) (диапазон изучаемых концентраций составляет 10-9-10-4 моль/л). 2 16827 1 2013.02.28 Влияние соединений на жизнеспособность макрофагов оценивают в тесте с трипановым синим (0,1 ) 16. Регистрацию ЛХЛ проводят при 37 С на протяжении 40 минут. Количественную оценку образования АФК осуществляют по площади под кривой ЛХЛ ( ХЛ, мВ). Показатели ЛХЛ-проб, содержащих соединение 16, выражают вк контрольным значениям (без 16). Статистическую обработку результатов проводят с использованием парного-критерия, различия считают достоверными при вероятности ошибки 5(табл. 1). Активность соединения 16 и прототипа оценивают по степени подавления ХЛ, вычисляя эффективные ингибирующие концентрации (16-84) методом регрессионного анализа с использованием программного пакета 6,1 (табл. 2). Таблица 1 Сравнительная эффективность заявляемого вещества (соединения 16) и прототипа (альфа-токоферола) в отношении окислительного взрыва макрофагов-4 16 6 72,67,1 110 Примечание к табл. 1.- максимальная эффективная концентрация,максимальный эффект подавления ХЛ , указано средне значение и ошибка среднего. Как видно из табл. 1, соединение 16 подавляет оксидантный взрыв макрофагов и по максимальной эффективностисопоставимо с прототипом. Сравнительное изучение активности показало, что заявляемое соединение не уступает в активности прототипу во всем диапазоне эффективных концентраций (16-84) (табл. 2). Таблица 2 Эффективные ингибирующие концентрации заявляемого вещества (соединения 16), и прототипа (альфа-токоферола) на окислительный взрыв макрофагов 0,051,2 0,25,6 1,228,9 5,7137,0 Примечание к табл. 2. Указано среднее значениеи 95 доверительный интервал. По результатам теста с трипановым синим (0,1 ), соединение 16 не оказывает токсического действия на макрофаги во всем изученном диапазоне концентраций (10-9-10-4 моль/л). Пример 2. Определение модифицирующего действия заявляемого вещества на стимулирующий эффект ФНО- в отношении оксидантного взрыва макрофагов. Известно, что такие цитокины, как ФНО- и ИЛ-1 стимулируют оксидантный взрыв фагоцитов 17. Это свойство рассматривается как полезное при воспалительных заболеваниях инфекционной природы, однако при гипериммунных ответах, ассоциированных с воспалением и аллергией, оно определяет тяжесть тканевых повреждений. По этой причине поиск средств, способных подавлять реакции эффекторных клеток иммунной системы на цитокины, является актуальной задачей иммунофармакологии. Соединение 16 вводили подкожно мышам-самкам линии СВА, массой 20-25 г в дозах 10, 30, 100, 300 мг/кг в течение 5 суток, контрольным животным назначают плацебо(вода для инъекций). На 6-е сутки у животных выделяли перитонеальные макрофаги. 3 16827 1 2013.02.28 Макрофаги преинкубировали с ФНО- в концентрации 10 мкг/л в течение 45 минут при 38 С. В дальнейшем макрофаги переносили в кюветы люминометра (10 клеток/мл), добавляли люминол (710-5 М) и индуктор оксидантного взрыва - опсонизированный зимозан - в количестве 5107 частиц. Объем пробы составляет 1 мл. Исследование выполняли методом хемилюминесценции, как описано в примере 1. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического варианта критерия НьюменаКейлса, различия считали достоверными при 0,05. Результаты исследований представлены в табл. 3. Таблица 3 Действие соединения 16 в отношении респираторного взрыва макрофагов,индуцированного , на фоне ФНО- и в его отсутствие ( ХЛ,к контролю,ФНО-Контроль (плацебо) 100,09,3 251,020,3 10 105,912,7 208,17,7 30 134,418,3 165,611,3 С 16 100 112,76,2 103,216,1 300 91,813,0 86,522,4- 0,05 по критерию Ньюмена-Кейлса в сравнении с контролем (ФНО-). Установлено, что при 5-дневном введении соединение 16 не изменяет последующего ответа макрофагов на , однако дозозависимо угнетает стимулирующее действие ФНО на оксидантный взрыв фагоцитов. Это действие имеет важное биологическое значение, поскольку угнетает развитие тканевых повреждений при гипериммунных ответах, что является полезным свойством при воспалении, аллергии, шоковых реакциях и реакции отторжения трансплантата. По результатам изучения токсичности на белых рандомбредных мышах и крысах линии , соединение 16 относится к мало токсичным веществам ( класс опасности). Еще одним преимуществом заявляемого соединения по сравнению с прототипом является его способность вступать во взаимодействия с углерод-центрированными радикалами органических молекул и тормозить реакции дефрагментации, ведущие к разрушению молекулярных и надмолекулярных биоструктур 14. Подобные реакции признаны одним из ведущих механизмов клеточных и тканевых повреждений, развивающихся вследствие гиперпродукции АФК активированными фагоцитами и другими клетками. Вещества, способные тормозить процессы фрагментации органических молекул, являются перспективными с позиции разработки новых лекарственных средств. Таким образом, заявляемое соединение позволяет решить поставленную задачу. Применение 5-метокси-1,3-бензоксатиол-2-она приводит к подавлению окислительного взрыва фагоцитов - важнейшего механизма иммунной реактивности и повреждения при воздействии активированных фагоцитарных клеток на ткани. Заявляемое соединение может быть использовано в экспериментально-исследовательской работе для изучения клеточных механизмов иммунной резистентности и АФКзависимого повреждения биоструктур в настоящий момент, а также для разработки нового иммуномодулирующего лекарственного средства после дополнительного доклинического и клинического изучения. Источники информации 1. Земсков В.М., Барсуков А.А., Безносенко С.А. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток) / Хаитов Р.М.,4 16827 1 2013.02.28 Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М. ВНИРО, 1995. - Гл. 6. С. 154-162. 2. Гомес Л.А., Ярцев М.Н., Барсуков А.А., Присяжнюк В.Л. Хроническая гранулематозная болезнь спектр клинико-лабораторных нарушений, тактика терапии // Педиатрия. 1991. -8. - С. 65-70. 3..// . . . - 1993. - . 67. - . 2-15. 4.,.,. .//. - 2006. - . 111. . 1-20. 5. Клиническая иммунология и аллергология. Учебное пособие / Под ред. А.В.Караулова. - М. Медицинское информационное агентство, 2002. - 651 с. 6. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Беларуси Справочник. - М. АстраФармСервис, 2007. - 976 с. 7. Патент 005626883 , МПК 01 31/02, 1997. 8..,., -,-// .. - 1990. - . 62. - . 27-58. 9. Патент 007718814 2, МПК 07 311/00,07 315/00, 2010. 10.,.,.,,- ( ) // . . . - 1985. - . 37. . 4. - . 449-459. 11. Клиническая фармакология по Гудману и Гилману / Под общ. ред. А.Г.Гилмана. В четырех томах. Кн. вторая. - М. Практика, 2006. - С. 557-558. 12.// . . . . - 1974. - . 291. - . 1187-1188. 13..,.,.-.//. 1984. - . 257. - . 3. - . 388-99. 14.,,-// Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5