Иммуномодулирующее и антиоксидантное средство

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Бизунок Наталья Анатольевна Дубовик Борис Валентинович Шадыро Олег Иосифович Полозов Генрих Иванович(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет МЕЗЕН Н.И. и др. Медицинский журнал. - 2007. -2. КСЕНДЗОВА Г.А. и др. Сахаровские чтения 2005 года экологические проблемывека. Материалы 5-й международной научной конференции. Ч. 1. - Минск, 2005. - С. 110-112.. в качестве иммуномодулирующего средства в сочетании с антиоксидантным действием. Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, гематологии, фармакологии, фармации, и может быть использовано для разработки нового лекарственного средства иммуномодулирующего и антиоксидантного типа действия. Способность фагоцитов продуцировать и выделять в окружающую среду активные формы кислорода (АФК) называется оксидантным (окислительным) взрывом 1. Это явление имеет важное биологическое значение для нормального функционирования иммунитета, поскольку обеспечивает разрушение фагоцитированных чужеродных объектов. Недостаточность ферментного комплекса (-оксидазы), ответственного за реализацию оксидантного взрыва, приводит к тяжелому заболеванию - хронической гранулематозной болезни 2, 3. В то же время избыточная продукция АФК фагоцитами является 17006 1 2013.04.30 одной из причин многих патологических состояний, включая ишемическореперфузионные повреждения миокарда, атеросклероз, гепатиты и циррозы печени, хронические артриты (в том числе подагрический), хронические воспалительные заболевания легких и реакцию отторжения трансплантата 4. В связи с этим поиск веществ, способных подавлять оксидантный взрыв фагоцитов и посредством этого оказывать лечебный эффект, является актуальным направлением работ в области иммунофармакологии. Подобные средства часто сочетают иммуномодулирующую (иммунокорректорную) активность с антиоксидантным (антиокислительным) действием. Иммуномодуляция (иммунокоррекция) - исправление дефектного функционирования иммунной системы, проявляющееся в усилении ослабленного или торможении стимулированного звена иммунитета 5. В соответствии с международной анатомо-терапевтическо-химической (АТХ) классификацией лекарственных средств к иммуномодуляторам относят, прежде всего, лекарственные средства, входящие в группу- противоопухолевые препараты и иммуномодуляторы, а также 01 - противовоспалительные и противоревматические препараты,06 - антигистаминные препараты для системного применения, 11- витамины и отдельные средства других групп. Термином антиоксиданты (антиокислители) в медицине обозначают природные или синтетические вещества, замедляющие или предотвращающие процессы свободнорадикального окисления органических молекул в клетках животных и человека 6. Антиоксидантным действием обладают многие лекарственные средства, имеющие различную химическую структуру и относящиеся к разным фармакотерапевтическим группам. Антиоксидантное действие обычно рассматривается как дополнительное полезное свойство таких препаратов. Известны иммуномодуляторы, подавляющие оксидантные функции фагоцитов аскорбиновая кислота 8, 9, альфа-токоферол 9, 10, 12, колхицин 11, 13, 14, препараты эхинацеи, циклоспорин, микофеноловая кислота, цитостатики, глюкокортикостероиды и др. 7. Из них наиболее выраженной антиоксидантной активностью обладают аскорбиновая кислота, альфа-токоферол, препараты эхинацеи. Наиболее известные из них - альфа-токоферол и аскорбиновая кислота - в терапевтическом диапазоне концентраций не обладают высокой эффективностью в отношении оксидантного взрыва фагоцитов. Более того, в высоких дозах эти лекарственные средства могут усугублять оксидантные повреждения при их изолированном применении 15, 16, 17, 18. Препараты эхинацеи содержат комплекс действующих веществ, индивидуальный вклад каждого из которых в результирующий эффект недостаточно изучен, кроме того,препараты эхинацеи трудно стандартизировать, они относительно малоэффективны как модуляторы функции фагоцитов. Циклоспорин и микофеноловая кислота, а также цитостатики и глюкокортикостероиды опосредованно влияют на функции фагоцитов через регуляцию их взаимодействия с лимфоцитами. Они токсичны, обладают широким спектром побочных эффектов и противопоказаний к применению, дорогостоящи. В качестве прототипа избран колхицин, который используется для лечения подагры из-за выраженного подавляющего влияния на функции фагоцитов - макрофагов и нейтрофилов 14. К недостаткам прототипа относятся сложность получения, высокая стоимость, высокая токсичность, обусловленная подавлением клеточного деления, с клиническими проявлениями нарушения системы кроветворения, репродуктивной функции, регенерации эпителия желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, кожного эпидермиса. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств иммуномодулирующего и антиоксидантного типа действия, обладающих низкой токсичностью. Поставленная задача достигается применением для подавления функции фагоцитов (окислительного взрыва) ранее известного соединения 3,5-ди-трет-бутилпирокатехина формулы 2 Заявляемое соединение - 3,5-ди-трет-бутилпирокатехин - описано в литературе 19. Авторами обнаружены неочевидные свойства данного соединения, позволяющие применять его в качестве иммуномодулятора, подавляющего функцию фагоцитарных клеток, связанную с оксидантным взрывом и массивной продукцией активных форм кислорода (АФК). Среди иммуномодуляторов, применяемых в клинической практике, нами не обнаружено структурных аналогов заявляемого соединения. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Влияние заявляемого вещества на окислительный взрыв фагоцитов в перитонеальных макрофагах крыс. Генерируемые макрофагами при окислительном взрыве АФК регистрируют методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре -11251(Финляндия). Исследование начинают через 10 мин после внесения соединения 11 в кювету люминометра (10-9-10-4 моль/л), содержащую 106 жизнеспособных макрофагов в среде Хенкса, люминол (710-5 моль/л), индуктор окислительного взрыва фагоцитов опсонизированный зимозан 20 - в количестве 5107 частиц. Объем пробы составляет 1 мл, средой является раствор Хенкса без индикатора. Аналогичным образом изучают действие прототипа (колхицин) и аналога (альфа-токоферол) (диапазон изучаемых концентраций составляет 10-9-10-4 моль/л). Влияние соединений на жизнеспособность макрофагов оценивают в тесте с трипановым синим (0,1 ) 21. Регистрацию ЛХЛ проводят при 37 С на протяжении 40 мин. Количественную оценку образования АФК осуществляют по площади под кривой ЛХЛ ( ХЛ, мВ). Показатели ЛХЛ проб, содержащих соединение 11, выражают вк контрольным значениям(без соединения О 11). Статистическую обработку результатов проводят с использованием парного -критерия, различия считают достоверными при вероятности ошибки 5(табл. 1). Активность соединения О 11 и препаратов сравнения оценивают по степени подавления ХЛ, вычисляя эффективные ингибирующие концентрации (16-84) методом регрессионного анализа с использованием программного пакета 6.1 (табл. 2). Таблица 1 Сравнительная эффективность заявляемого вещества (соединения 11), аналога(альфа-токоферола) и прототипа (колхицина) в отношении окислительного взрыва макрофагов (по критериюХЛ) Вещества, шифр-6 11 6 97,30,9 110 Примечание.- максимальная эффективная концентрация,- максимальный эффект подавления ХЛуказано среднее значение и ошибка среднего. 0,01 в сравнении с колхицином и альфа-токоферолом. По результатам теста с трипановым синим (0,1 ) 11 не оказывает токсического действия на макрофаги во всем изученном диапазоне концентраций (10-9-10-4 моль/л). Как видно из табл. 1, соединение 11 полностью подавляет оксидантный взрыв макрофагов, превосходя по максимальной эффективностиоба препарата сравнения. 3 17006 1 2013.04.30 Сравнительное изучение активности показало, что диапазон эффективных концентраций (16-84) для заявляемого соединения существенно шире и находится в области более низких концентраций, чем для препаратов сравнения (табл. 2). По критерию 50 активность соединения О 11 превышает активность альфа-токоферола примерно в 2200 раз колхицина - в 3250 раз. Таблица 2 Эффективные ингибирующие концентрации заявляемого вещества (соединения 11), аналога (альфа-токоферола) и прототипа (колхицина) на окислительный взрыв макрофагов (16-84, мкмоль/л по критериюХЛ) Вещества, шифр 0,002-0,007 0,03-0,1 0,4-1,6 Примечание. Указано среднее значениеи 95 доверительный интервал . 0,001 при сравнении с колхицином и альфа-токоферолом. Пример 2. Влияние заявляемого вещества на фагоцитоз нейтрофилов в условиях. Влияние соединения О 11 на фагоцитоз нейтрофиловизучают в стандартном фагоцитарном тесте 22 на цельной крови 8 доноров (в возрасте 20-45 лет) по следующей схеме. К 0,3 мл гепаринизированной крови добавляют по 0,1 мл препаратов в различной концентрации, смесь осторожно перемешивают и выдерживают 30 мин при температуре 20-22 С. Затем в пробы вносят по 0,2 мл взвеси инактивированной суточной культуры 209 в концентрации 5108 микробных тел/мл и смесь инкубируют 30 мин при 37 С. В окрашенных мазках из лейкоцитарного слоя центрифугата при иммерсионной микроскопии анализируют по 200 нейтрофильных клеток и оценивают стандартные показатели фагоцитоза фагоцитарную активность (ФА) - долю фагоцитирующих клеток (в ) и фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число микробных тел на фагоцит. Статистическую обработку результатов проводят с использованием парного -критерия,различия считают достоверными при вероятности ошибки 5 . Результаты исследований представлены в табл. 3. Таблица 3 Влияние соединения О 11 на фагоцитарную активность нейтрофилов человека в условиях(8) ФА,ФИ, МТ/фагоцит эффективность 2 эффективность Контроль 51,25,2 1,0 4,70,4 1,0 0,001 41,08,8 0,8 4,40,6 0,9 0,01 56,34,1 1,1 4,10,8 0,9 0,1 53,27,2 1,0 3,80,7 0,8 1,0 46 Д 6,1 0,9 3,60,7 0,8 10,0 43,26,3 0,8 3,80,2 0,7 1 Примечание. Среднее значение и ошибка среднего значения. 2 Рассчитывается как отношение к контролю. 17006 1 2013.04.30 Установлено, что соединение 11 не оказывает ингибирующего действия на фагоцитарную активность нейтрофилов человека по критериям количества клеток, способных к фагоцитозу (ФА), и незначительно (на 30 ) снижает количество поглощенных микроорганизмов(ФИ) на клетку при максимальной изученной концентрации - 10,0 мкмоль/л (табл. 3). Пример 3. Влияние заявляемого вещества на фагоцитарную активность в условиях. Влияние соединения 11 на фагоцитарную активность в условияхизучают на 32 мышах-самцах линии , массой 20-25 г. Соединение 11 вводят в дозах 30, 100,300 мг/кг подкожно в течение 5 суток, контрольным животным назначают плацебо. На 6-е сутки у животных выделяют перитонеальные макрофаги.0,2 мл суспензии макрофагов,содержащей 106/мл жизнеспособных клеток, вносят 0,2 мл взвеси инактивированной суточной культуры 209 в концентрации 5108 микробных тел/мл, перемешивают и инкубируют 30 мин при 37 С 22. В окрашенных мазках из клеточного осадка при иммерсионной микроскопии анализируют по 200 макрофагальных клеток и оценивают стандартные показатели фагоцитоза фагоцитарную активность (ФА) - долю фагоцитирующих клеток (в ) и фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее число микробных тел на фагоцит. Статистическую обработку результатов проводят с использованием критерия Ньюмена-Кейлса, различия считают достоверными при р 0,05. Результаты исследований представлены в табл. 4. Установлено, что при пятидневном введении соединение 11 не оказывает значимого ингибирующего действия на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов. Таблица 4 Влияние соединения 11 на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей линии СВА (8) ФА,ФИ, МТ/фагоцит Относительная Относительная 1 эффективность 2 эффективность Контроль 42,38,1 1,0 2,70,5 1,0 30 33,87,4 0,8 2,40,4 0,9 100 38,16,3 0,9 2,20,4 0,8 300 50,85,5 1,2 2,10,7 0,8 Примечание. 1 Среднее значение и ошибка среднего значения. 2 Рассчитывается как отношение к контролю. По результатам изучения токсичности на белых рандомбредных мышах и крысах линиисоединение 11 относится к малотоксичным веществам ( класс опасности). Таким образом, заявляемое соединение позволяет решить поставленную задачу. Применение 3,5-ди-трет-бутилпирокатехина приводит к подавлению окислительного взрыва фагоцитов - важнейшего механизма иммунной реактивности и повреждения при воздействии активированных фагоцитарных клеток на ткани, поглотительная функция фагоцитов при этом не нарушается. Пример 4. Определение антиоксидантного действия заявляемого вещества. Использовали модель пероксид-индуцированной хемилюминесценции (ПХЛ) сыворотки крови крупного рогатого скота. После добавления к сыворотке 10-4 моль/л перекиси водорода в присутствии люминола возникает вспышка хемилюминесценции, на 10-й мин переходящая в стационарное свечение. Вспышка свечения обусловлена появлением при спонтанном разложении 22 в сыворотке крови высокоактивных радикалов кислорода,таких как 2 и 23. АФК регистрируют методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре 1251 (Финляндия). Количество АФК в модельной системе оценивают по максимальному значению вспышки свечения (мВ ПХЛ) Доза, мг/кг 17006 1 2013.04.30 и площади под кривой хемилюминесценции ( ПХЛ) за 10-минутный интервал после внесения 22. Показатели ХЛ проб, содержащих исследуемые соединения - альфатокоферол, колхицин, соединение 11 в концентрации 10-9-10-4 моль/л, выражают вк параллельно регистрируемым контрольным значениям ПХЛ. Антиоксидантную активность соединений оценивают по степени снижения ПХЛ, определяя методом линейной регрессии эффективные ингибирующие концентрации (16-84), уменьшающие выход хемилюминесценции на 1684 . Сравнительное изучение показало, что антиоксидантной активностью в модельной биосреде (сыворотке крови) обладают альфа-токоферол и заявляемое соединение (11),колхицин не проявлял антиоксидантной активности. Диапазон эффективных концентраций (16-84) заявляемого соединения и альфатокоферола (наиболее широко используемого в медицинской практике антиоксиданта) существенно различался. Для соединения 11 эффективный диапазон шире, чем для альфа-токоферола, и находится в области более низких концентраций (табл. 5). По критериям 16-50 антиоксидантная активность соединения О 11 превышает активность альфатокоферола от 85 до 3 раз в биологически адекватном диапазоне концентраций. Таблица 5 Эффективные ингибирующие концентрации заявляемого вещества (соединения 11) и аналога (альфа-токоферола) на пероксид-индуцированную хемилюминесценцию сыворотки крови (16-84, мкмоль/л, по критериюПХЛ) Название 0,08 1,5 31,6 11 100 1000,06-0,1 1,1-2,1 23,7-42,3 Примечание. Указано среднее значение (М) и 95 доверительный интервал . 0,001 при сравнении с альфа-токоферолом. Таким образом, заявляемое соединение позволяет решить поставленную задачу. При индукции оксидантных процессов в биосреде (сыворотке крови) 3,5-ди-третбутилпирокатехин обладает выраженной антиоксидантной активностью. Заявляемое соединение может быть использовано в экспериментальноисследовательской работе для изучения клеточных механизмов иммунной резистентности и АФК-зависимого повреждения биоструктур, а также для разработки нового лекарственного средства после дополнительного доклинического и клинического изучения. Источники информации 1. Земсков В.М., Барсуков А.А., Безносенко С.А. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток) Хаитов Р.М.,Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М. ВНИРО, 1995. - Гл. 6. С. 154-162. 2. Гомес Л.А., Ярцев М.Н., Барсуков А.А., Присяжнюк В.Л. Хроническая гранулематозная болезнь спектр клинико-лабораторных нарушений, тактика терапии // Педиатрия. 1991. -8. - С. 65-70. 3.// . . . - 1993. - . 67. - . 2-15. 4.,,//. - 2006. . 111. - . 1-20. 6 17006 1 2013.04.30 5. Клиническая иммунология и аллергология. Учебное пособие / Под ред. А.В. Караулова. - М. Медицинское информационное агенство, 2002. - 651 с. 6. Мартин Э.А. Большой толковый медицинский словарь. Основные термины и понятия по медицине. Т. 1. А. - М. Издательство АСТ, 2001. - 592 с. 7. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Беларуси Справочник. - М. АстраФармСервис, 2007. - 976 с. 8.005626883, МПК 01 31/02, 1997. 9..,., -,-// .. - 1990. - . 62. - . 27-58. 10.0077188142, МПК 07 311/00,07 315/00, 2010. 11. Клиническая фармакология по Гудману и Гилману / Под общ. ред. А.Г. Гилмана. В 4-х т. Кн. 2. - М. Практика, 2006. - С. 557-558. 12..,.,.,,- ( ) // . . . - 1985. - . 37. . 4. - . 449-459. 13.// . . . . - 1974. - . 291. - . 1187-1188. 14..,.,..//. 1984. - . 257. -. 3. - . 388-99. 15. Бринкевич С.Д., Шадыро О.И. Влияние аскорбиновой кислоты и ее производных на радиационно-химические превращения гидроксилсодержащих органических соединений // Химия высоких энергий. - 2008. - Т. 42. -4. - С. 297-302. 16. Повалишев В.Н., Полозов Г.И., Шадыро О.И. Влияние а-токоферола и его серосодержащих аналогов на радиационно-химические превращения гексана и этанола // Химия высоких энергий. - 2006. - Т.40. -5. - С. 349-354. 17..,.,.,.,.,.-3//.. - 2010. - . 102. - . 1224-1234. 18.,//. - 1992. - . 26. . 9-10. - . 657-676. 19.,,,,,,,-//. - 2002. - . 36. - . 8. - . 859-867. 20..,.,,., , ,23187// . . - 1988. . 17. - . 3. - . 419-426. 21. Дуглас С.Д., Куй П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике. - М. Медицина, 1983. - 112 с. 22. Лабинская Н.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М. Медицина, 1978. - С. 143-147. 23. Шестаков В.А., Бойчевская Н.О., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция плазмы крови в присутствии перекиси водорода // Биофизика. - 1978. -4. - С. 132-137. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7