Индуктор окислительного взрыва фагоцитов, иммуностимулирующее средство

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ИНДУКТОР ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ВЗРЫВА ФАГОЦИТОВ,ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Бизунок Наталья Анатольевна Дубовик Борис Валентинович Шадыро Олег Иосифович Ксендзова Галина Анатольевна Сорокин Виктор Леонидович(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет в качестве индуктора окислительного взрыва фагоцитов, иммуностимулирующего средства. Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к иммунологии, гематологии, фармакологии, фармации, клеточной биологии, и может быть использовано в лабораторной диагностике и экспериментальной практике для оценки защитной функции фагоцитарных клеток, связанной с их способностью продуцировать активные формы кислорода (АФК). Это явление, присущее фагоцитам и называемое оксидантным (окислительным) взрывом, имеет важное биологическое значение для нормального функционирования иммунитета, поскольку обеспечивает разрушение фагоцитированных чужеродных объектов. Кроме того, оксидантный взрыв макрофагов необходим для процессинга захваченного объекта и его презентации на клеточной поверхности, а также для наработки 16612 1 2012.12.30 цитокинов, что в совокупности обеспечивает адекватную индукцию лимфоцитарных механизмов иммунного ответа. Генетически детерминированные нарушения оксидантного взрыва проявляются тяжелой патологией - хронической гранулематозной болезнью 1,2. Недостаточность оксидантного взрыва может развиваться и при различных приобретенных иммунодефицитах, следствием чего являются снижение резистентности к инфекции, хронизация течения инфекционных процессов, индукция опухолевого роста 3,4. Недостаточность функции фагоцитов требует применения лекарственных средств иммуностимулирующего типа действия. Иммуностимуляторы - средства, усиливающие иммунный ответ (лекарственные препараты или пищевые добавки, стимулирующие иммунные процессы) 5. По механизму действия можно выделить иммуностимулирующие препараты с преимущественным эффектом на моноциты/макрофаги, - и -лимфоциты и -клетки 6. Сущность иммуностимулирующего действия средств, влияющих на моноциты/макрофаги, сводится к следующему. При проникновении микроба в макроорганизм первой клеткой, которая вступает в борьбу с ним, является тканевой макрофаг. Он поглощает и переваривает микробы, презентируя их антигенные пептиды - и -клеткам и инициируя тем самым развитие клеточного и гуморального ответа. При этом макрофаг выделяет цитокины, которые активируют механизмы неспецифической резистентности, и клетки, их реализующие, - нейтрофилы, моноциты/макрофаги, -клетки. Кроме того,цитокины действуют на - и -лимфоциты, способствуя развитию специфического иммунитета. Таким образом, макрофаги являются первыми клетками, инициирующими проявления неспецифической резистентности и специфического иммунного ответа. Лекарственными средствами, стимулирующими функции макрофагов, а также нейтрофилов и других гранулоцитов являются, прежде всего, препараты микробного происхождения (продигиозан, пирогенал, рибомунил, ликопид и др.), а также полимерный иммуномодулятор полиоксидоний 7. Недостатками этих средств являются низкая избирательность действия в отношении иммунных механизмов защиты, высокая индивидуальная вариабельность эффективности,технологически сложная и дорогая система промышленного производства, определяющая высокую стоимость конечного продукта, сложность стандартизации готовых лекарственных средств, широкий спектр противопоказаний и побочных эффектов при их применении. Эти недостатки свидетельствуют об актуальности изыскания новых лекарственных средств иммуностимулирующего типа действия с преимущественным влиянием на функции фагоцитов. Что касается лабораторной и экспериментальной практики, то в качестве средств индукции респираторного взрыва фагоцитов здесь также используют продукты бактериального происхождения или хемотаксические пептиды. Например, известен иммуностимулятор и индуктор окислительного взрыва фагоцитов- (-формил-метионил-лейцил-фениналанин ) 8, 9, 10, который представляет собой соединение пептидной структуры. К недостаткам аналога относятся сложность получения, высокая стоимость, низкая стабильность, требующая глубокого охлаждения, высокая токсичность. Также известен форбол-12-миристат-13-ацетат (12 13-,) - продукт, выделенный из оболочки туберкулезных бактерий 10. К его недостаткам относятся сложность выделения чистого продукта и поэтому высокая стоимость, высокая токсичность, а также низкая стабильность, требующая глубокого охлаждения,фоточувствительность. 16612 1 2012.12.30 В качестве прототипа выбран опсонизированный зимозан, который представляет собой сухие пекарские дрожжи, убитые нагреванием и опсонизированные иммуноглобулинами и компонентами комплемента, содержащимися в сыворотке крови 10, 11. Недостатками прототипа являются низкая стабильность, высокая вариабельность клеточного ответа и низкая эффективность в качестве индуктора фагоцитарной продукции оксидантов. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, индуцирующих окислительный взрыв фагоцитов и обладающих иммуностимулирующим действием. Поставленная задача достигается применением для индукции окислительного взрыва фагоцитов ранее известного соединения 3,5-ди-трет-бутил-2-метоксифениланилина формулы Заявляемое соединение 3,5-ди-трет-бутил-2-метоксифениланилин описано в литературе 12. Авторами обнаружены неочевидные свойства данного соединения, позволяющие применять его в качестве индуктора окислительного взрыва фагоцитов. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Определение влияния заявляемого вещества на окислительный взрыв фагоцитов в перитонеальных макрофагах крыс. Генерируемые макрофагами при окислительном взрыве АФК регистрировали методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре 1251 (Финляндия). Исследование начинали сразу после внесения соединения -21 в кювету люминометра, содержащую 106 жизнеспособных макрофагов в среде Хенкса и люминол (710-5 М),контрольные пробы не содержали заявляемого соединения. Конечные концентрации соединения -21 составляли 10-9-10-5 М. Для сравнения опсонизированный зимозан (представлен под шифром ) вносили в кюветы с макрофагами (106) и люминолом (710-5 М) в количестве 5107 частиц (максимальная эффективная концентрация). Объем пробы составлял 1 мл, питательной средой являлся раствор Хенкса без индикатора. Регистрацию ЛХЛ проводили при 37 С на протяжении 30 минут. Количественную оценку образования АФК осуществляли по площади под кривой ЛХЛ ( ХЛ, мВ(103 и максимальному значению люминесценцииХЛ, мВ. Показатели ЛХЛ проб,содержащих соединение -21, выражали вк контрольным значениям (без индуктора). Статистическую обработку результатов проводили с использованием парного -критерия,различия считали достоверными при вероятности ошибки 5 . Действие соединения -21 и прототипа представлено в табл. 1. 16612 1 2012.12.30 Таблица 1 Сравнительное действие заявляемого вещества (соединения -21) и прототипана окислительный взрыв макрофагов Индуктор, шифр Примечание 1 Среднее значение и ошибка среднего значения. 2- относительная эффективность. Рассчитывается как отношение люминесценции проб, содержащих -21 (контрольных), к пробам, содержащим . Отличие -21 отдостоверно с 0,01 по парному -критерию (двусторонний вариант). 3 Максимальная эффективная концентрация . Сущность изобретения поясняется фигурой, на которой представлено действие соединения -21 и прототипана хемилюминесценцию макрофагов. Индукторы вносились в нулевой момент времени. Видно, что действие соединения -21 имеет больший латентный период и по эффективности соединение -21 превосходит прототип. Результаты исследования свидетельствуют о выраженном стимулирующем действии соединения -21 на оксидантный взрыв фагоцитов (фигура, табл. 1). При внесении соединения -21 в клеточную систему макрофаги-люминол на 15-20-й минуте развивается интенсивное свечение, которое достигает максимума к 30-й минуте, а затем медленно затухает (фигура). Действие соединения -21 носит дозозависимый характер и достигает максимума при 10,0 мкМ (табл. 1). Интенсивность свечения, вызванного соединением -21, превосходит люминесценцию, индуцированную опсонизированным зимозаном примерно в 5 раз по критериюХЛ и в 12 раз по критериюХЛ. Внесение соединения -21 в среду с люминолом, не содержащую макрофаги (люминол-Хенкс) или содержащую убитые клетки, не приводило к вспышке свечения. Представленные данные свидетельствуют, что эффект 3,5-ди-трет-бутил-2-метоксифениланилина обусловлен индукцией естественных АФК-генерирующих механизмов, присущих только жизнеспособным клеткам 10. Пример 2. Определение модифицирующего действия заявляемого вещества на опосредованную интерлейкином-1 альфа (ИЛ-1) стимуляцию оксидантного взрыва фагоцитов. Известно, что отдельные цитокины, например ИЛ-1, оказывают стимулирующее действие на оксидантный взрыв фагоцитов 13. Это свойство рассматривается как полезное при воспалительных заболеваниях инфекционной природы. Модифицирующее действие соединения -21 на опосредованную интерлейкином-1 альфа (ИЛ-1) стимуляцию оксидантного взрыва фагоцитов изучали следующим образом. Соединение -21 вводили подкожно мышам-самкам линии СВА, массой 20-25 г в дозах 10, 30, 100 мг/кг в течение 5 суток, контрольным животным назначают плацебо. На 6-е сутки у животных выделяли перитонеальные макрофаги. Макрофаги преинкубировали с ИЛ-1 (, Германия) в концентрации 100 мкг/л в течение 40 минут при 38 С. В дальнейшем макрофаги переносили в кюветы люминометра (106 клеток/мл), добавляли люминол (710-5 М) и индуктор оксидантного взрыва - опсонизированный зимозан в количестве 5107 частиц. Объем пробы составляет 1 мл. Исследование выполняли методом хемилюминесценции, как описано в примере 1. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического варианта критерия Ньюмена-Кейлса, различия считали достоверными при 0,05. Результаты исследований представлены в табл. 2. 4 16612 1 2012.12.30 Таблица 2 Действие соединения -21 в отношении респираторного взрыва макрофагов,индуцированного , на фоне ИЛ-1 и в его отсутствие-21 30 94,419,3 365,615,3 100 111,77,6 407,225,6 0,05 по критерию Ньюмена-Кейлса в сравнении с контролем (ИЛ-1). Установлено, что при 5-дневном введении соединение -21 не изменяет ответ фагоцитов на , однако дозозависимо усиливает стимулирующее действие ИЛ-1 на оксидантный взрыв фагоцитов. Эффект, заключающийся в усилении ответа эффекторной системы на одни стимулы после действия других, называется в фармакологии сенситизацией. Сенситизация фагоцитов к эффектам цитокинов, в данном случае к ИЛ-1, имеет важное биологическое значение, поскольку ведет к усилению оксидантного взрыва и более эффективному разрушению поглощенных фагоцитами объектов, что является полезным свойством для антиинфекционной и противоопухолевой защиты. Таким образом, заявляемое техническое решение достигает поставленной цели. Внесение 3,5-ди-трет-бутил-2-метоксифениланилина в суспензию макрофагов приводит к мощной индукции окислительного взрыва. Применение 3,5-ди-трет-бутил-2-метоксифениланилинаповышает чувствительность макрофагов к стимулирующему эффекту ИЛ-1 в отношении оксидантного взрыва. Заявляемое соединение может быть использовано в лабораторной практике для диагностики нарушений фагоцитарной функции при иммунодефицитах, в экспериментальноисследовательской работе для изучения клеточных механизмов иммунитета, а также для разработки лекарственных средств иммуностимулирующего типа действия. Источники информации 1. Гомес Л.А., Ярцев М.Н., Барсуков А.А., Присяжнюк В.Л. Хроническая гранулематозная болезнь спектр клинико-лабораторных нарушений, тактика терапии // Педиатрия. 1991. -8. - С. 65-70. 2.// . . . - 1993. - . 67. - . 2-15. 3.// .. . - 2000. - . 76. - . 457-465. 4. Клиническая иммунология и аллергология Учебное пособие / Под ред. А.В.Караулова. - М. Медицинское информационное агенство, 2002. - 651 с. 5. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. - 1996. - Т. 74. -8. - С. 7-12. 6.// - 1993. - . 14. - . 275-280. 7. Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Ежегодный сборник. Вып. 9. ООО РЛС-2002, 2002. - 1504 с. 8. Патент 98/45466, МПК 12 9/00,07 9/02,61 31/66, 1998. 9. Патент 006121237, МПК 01 33/567,01 33/48, 2000. 10.Т.,. .,,., , ,23187// . . - 1988. . 17. - . 3. - . 419-426. 5 16612 1 2012.12.30 11. Патент 005108899, МПК 61 38/08,61 38/10,61 38/16, 1992. 12. Базиль О.К., Артюхов В.Я., Майер Г.В., Райченок Т.Ф., Скорняков И.В., Толсторожев Г.В., Шадыро О.И., Сорокин В.Л., Ксендзова Г.А. Электронная структура, спектрально-люминесцентные и протон акцепторные свойства биологически активных аминофенолов // Оптика и спектроскопия. - 2009. - Т. 107. -4. - С. 596-606. 13.,- -1// . . . - 1991. . 49. - . 107-115. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6