Иммуномодулирующее средство

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Бизунок Наталья Анатольевна Дубовик Борис Валентинович Шадыро Олег Иосифович(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(56)... - 2008. - . 52. . 1. - . 121-127. БИЗУНОК Н.А. Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус, сер. мед. навук. - 2006. -4. - С. 84-86.. .. .. - 2011. . 50. - . 2. - . 110-123.1138323 2, 2001.(57) Применение комбинации транс-ресвератрола с мелатонином в молярном соотношении от 11 до 1100 в качестве иммуномодулирующего средства. Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, гематологии, фармакологии, фармации, и может быть использовано для разработки новых лекарственных средств иммуномодулирующего типа действия. Способность фагоцитов продуцировать и выделять в окружающую среду активные формы кислорода (АФК) называется оксидантным (окислительным) взрывом 1. Это явление имеет важное биологическое значение для нормального функционирования иммунитета, поскольку обеспечивает разрушение фагоцитированных чужеродных объектов. Недостаточность ферментного комплекса (-оксидазы), ответственного за реализацию оксидантного взрыва, приводит к тяжелому заболеванию - хронической гранулематозной болезни 2, 3. В то же время избыточная продукция АФК фагоцитами является одной из причин многих патологических состояний, включая ишемическо-реперфузионные повреждения миокарда, атеросклероз, гепатиты и циррозы печени, хронические артриты (в том числе подагрический), хронические воспалительные заболевания легких и реакцию отторжения трансплантата 4. В связи с этим поиск веществ, способных подавлять оксидантный взрыв фагоцитов и посредством этого оказывать лечебный эффект является актуальным направлением работы в области иммунофармакологии. Иммуномодуляция (иммунокоррекция) - исправление дефектного функционирования иммунной системы, проявляющееся в усилении ослабленного или торможении стимулированного звена иммунитета 5. В соответствии с международной анатомотерапевтическо-химической (АТХ) классификацией лекарственных средств к иммуномодуляторам 16758 1 2013.02.28 относят, прежде всего, лекарственные средства, входящие в группу- противоопухолевые препараты и иммуномодуляторы, а также 01 - противовоспалительные и противоревматические препараты, 06 - антигистаминные препараты для системного применения,11 - витамины и отдельные средства из других фармакотерапевтических групп 6. Известны иммуномодуляторы, подавляющие оксидантные функции фагоцитов аскорбиновая кислота 7, 8, альфа-токоферол 8, 9, 10, колхицин 11, 12, 13, мелатонин 14,15, 16, 17, ресвератрол 18, 19, препараты эхинацеи, циклоспорин, микофеноловая кислота, цитостатики, глюкокортикостероиды и др. 6. Из них циклоспорин и микофеноловая кислота, а также цитостатики и глюкокортикостероиды опосредованно влияют на функции фагоцитов, через регуляцию их взаимодействия с лимфоцитами. Они высокотоксичны, обладают широким спектром побочных эффектов и противопоказаний к применению, дорогостоящи. Препараты эхинацеи содержат комплекс действующих веществ, индивидуальный вклад каждого из которых в результирующий эффект не достаточно изучен, кроме того,препараты эхинацеи трудно стандартизировать, они относительно малоэффективны как модуляторы функции фагоцитов. Альфа-токоферол, аскорбиновая кислота в терапевтическом диапазоне концентраций не обладают высокой эффективностью в отношении оксидантного взрыва фагоцитов. Более того, в высоких дозах эти лекарственные средства могут усугублять оксидантные повреждения при их изолированном применении 20, 21, 22, 23. Колхицин из-за выраженного подавляющего влияния на функции фагоцитов - макрофагов и нейтрофилов - используется для лечения подагры 11, 13. К его недостаткам относятся сложность получения, высокая стоимость, высокая токсичность, обусловленная нарушением клеточного деления, с клиническими проявлениями нарушения системы кроветворения, репродуктивной функции, регенерации эпителия желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, кожного эпидермиса. В качестве прототипов избраны изолированные компоненты заявляемых комбинаций ресвератрол и мелатонин. Эти вещества подавляют оксидантный взрыв фагоцитов при изолированном применении 16, 17, 18, 19, обладая при этом умеренной эффективностью. Ресвератрол и мелатонин имеют разные мишени действия в фагоцитарных клетках,что позволяет прогнозировать синергизм при их комбинированном применении. Синергичное иммунокорректорное действие комбинаций ресвератрола и мелатонина в литературе не описано. Синергизм в фармакологии - это явление взаимного усиления эффективности лекарственных средств при их совместном применении по сравнению с применением изолированным. Создание синергичных комбинаций является важнейшим направлением разработки новых лекарственных средств. Более того, выявление фармакодинамического синергизма лекарственных средств чрезвычайно важно для клинической практики, поскольку позволяет не только обосновать целесообразность их совместного назначения, но и уменьшить дозы каждого из них в комбинации, что минимизирует побочные эффекты и токсические риски. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств иммуномодулирующего типа действия. Поставленная задача достигается применением комбинации транс-ресвератрола с мелатонином в молярном соотношении от 11 до 1100 в качестве иммуномодулирующего средства. Заявляемые комбинации транс-3,5,4-тригидроксистилбена (ресвератрола) и -(2-(5 метокси-1-индол-3-ил)-1-пропен-2-амина (мелатонина) в литературе не описаны. Авторами обнаружены неочевидные свойства комбинаций ресвератрола и мелатонина, позволяющие усилить иммуномодулирующий потенциал этих соединений и приме 2 16758 1 2013.02.28 нять их в качестве средств, подавляющих функцию фагоцитарных клеток, связанную с оксидантным взрывом и массивной продукцией активных форм кислорода (АФК), повреждающих окружающие ткани. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Определение действия комбинаций ресвератрола и мелатонина на окислительный взрыв фагоцитов в перитонеальных макрофагах крыс. Изучено 3 молярных комбинаторных сочетания ресвератрола и мелатонина 1/1, 1/10 и 1/100 в диапазоне концентраций (10-8-10-5 М - ресвератрол 10-7-10-4 М - мелатонин). Генерируемые макрофагами при окислительном взрыве АФК регистрируют методом люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) на люминометре 1251 (Финляндия). Исследование начинают через 10 мин после внесения ресвератрола (10-910-5 моль/л), мелатонина (10-9-10-3 моль/л) или их комбинации (10-8-10-5 моль/л - ресвератрол 10-7-10-4 моль/л - мелатонин) в кювету люминометра, содержащую 106 жизнеспособных макрофагов в растворе Хенкса, люминол (710-5 моль/л), индуктор окислительного взрыва фагоцитов - опсонизированный зимозан 24 - в количестве 5107 частиц. Объем пробы составляет 1 мл, средой является раствор Хенкса без индикатора. Аналогичным образом изучают действие аналога (колхицин, 10-9-10-4 моль/л). Влияние соединений на жизнеспособность макрофагов изучают в тесте с трипановым синим (0,1 ) 25. Регистрацию ЛХЛ проводят при 37 С на протяжении 40 мин. Количественную оценку образования АФК осуществляют по площади под кривой ЛХЛ ( ХЛ, мВ). Показатели ЛХЛ проб, содержащих изучаемые соединения, выражают вк контрольным значениям. Статистическую обработку результатов проводят с использованием парного-критерия, различия считают достоверными при вероятности ошибки 5(табл. 1). Активность испытуемых соединений оценивают по степени подавления ХЛ, вычисляя эффективные ингибирующие концентрации (16-84) методом регрессионного анализа с использованием программного пакета 6,1. Анализ взаимодействия. Результат взаимодействия ресвератрола и мелатонина оценивали по значению комбинаторного индекса , который рассчитывали по формуле (1)( ),1 где- доза (концентрация) агента, оказывающая эффект определенной силы при комбинированном применении- доза (концентрация) агента, оказывающая аналогичный эффект при индивидуальном применении. Значениятрактовали в соответствии с известной шкалой 260,1 - очень сильный синергизм (5)0,1-0,3 - сильный синергизм (4)0,3-0,7 - синергизм (3)0,7-0,85 - умеренный синергизм (2)0,85-0,90 - слабый синергизм (1)0,90-1,10 - аддитивный эффект (0)1,10-1,20 - слабый антагонизм (1-)1,201,45 - умеренный антагонизм (2-)1,45-3,3 - антагонизм (3-)3,3-10,0 - сильный антагонизм (4-)10 - очень сильный антагонизм (5-). Индекс снижения дозыкомпонентов комбинации рассчитывали по формуле (2)( )показывает, во сколько раз можно снизить дозу каждого компонента комбинации для достижения того же эффекта, который вызывают компоненты при их изолированном применении. Результаты исследования представлены в табл. 1-3. 16758 1 2013.02.28 Таблица 1 Сравнительная эффективность изолированного и комбинированного воздействия аналога (колхицина), прототипов (ресвератрола и мелатонина) и заявляемых комбинаций ресвератрола и мелатонина на окислительный взрыв макрофагов-4 1/100 5 10 /10 81,21,9 Примечание к табл. 1.- максимальная эффективная концентрация, ах максимальный эффект, вподавления ХЛ, указано среднее значение и ошибка среднего р 0,05 в сравнении с изолированным действием колхицина, мелатонина и ресвератрола. По результатам теста с трипановым синим (0,1 ), заявляемые комбинации ресвератрола и мелатонина не оказывают токсического действия на макрофаги во всем изученном диапазоне концентраций. Таблица 2 Значения комбинаторного индексадля комбинаций ресвератрола и мелатонина(по критериюХЛ)для 16 84 2 КОК 130-703 Результат взаимодействия 16 30 50 70 84 1/1 1,540 0,794 0,398 0,199 0,103 0,563 3 1/10 0,067 0,074 0,082 0,091 0,101 0,080 5 1/100 0,075 0,054 0,039 0,028 0,021 0,045 5 Таблица 3 Значения индекса снижения дозыдля комбинаций ресвератрола и мелатонина(по критериюХЛ),КОК 30-70 16 30 50 70 84 1/1 83,1 183,3 419,1 958,1 2114,1 391,0 0,7 1,3 2,5 5,0 9,8 2,3 1/10 203,4 208,2 213,4 218,8 224,0 211,7 16,0 14,4 12,9 11,5 10,4 13,4 1/100 30,3 44,9 67,8 102,2 151,5 62,1 23,9 31,1 40,9 53,8 70,0 38,2 1 2 Примечание к табл. 2 и 3. - комбинаторное отношение компонентов - 16 84 концентрации модулятора, ингибирующие оксидантный взрыв на 1684 по сравнению с контролем (в отсутствие модулятора) 3 - средневзвешенное значение рассчитывается как 30-7033025070/6. Мелатонин и ресвератрол обладают иммуномодулирующим потенциалом при изолированном воздействии на макрофаги 7-10, 14-19. При комбинированном применении они синергично действуют на оксидантный взрыв макрофагов во всех изученных комбинаторных сочетаниях, о чем свидетельствует увеличение максимальной эффективности иммуномодулирующего действия (табл. 1), а также значения комбинаторных индексов,позволяющие классифицировать взаимодействие ресвератрола и мелатонина, как синергизм и очень сильный синергизм (табл. 2). 4 16758 1 2013.02.28 Значения индексов снижения дозы (табл. 3) свидетельствуют, что комбинированное применение ресвератрола и мелатонина позволяет значительно уменьшить их дозы (концентрации) при достижении эффекта любой силы. Таким образом, комбинации ресвератрола с мелатонином в молярных соотношениях 1/11/100 позволяют решить поставленную задачу. Применение ресвератрола и его комбинаций с мелатонином в молярных соотношениях 1/11/100 приводит к подавлению окислительного взрыва фагоцитов - важнейшего механизма иммунной реактивности и повреждения при воздействии активированных фагоцитарных клеток на ткани. Комбинации ресвератрола с мелатонином в молярных соотношениях 1/11/100 могут быть использованы в качестве лекарственных средств иммуномодулирующего типа действия. Источники информации 1. Земсков В.М., Барсуков А.А., Безносенко С.А. Изучение функционального состояния фагоцитов человека (кислородный метаболизм и подвижность клеток) / Хаитов Р.М.,Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М. ВНИРО, 1995. Гл. 6. С. 154-162. 2. Гомес Л.А., Ярцев М.Н., Барсуков А.А., Присяжнюк В.Л. Хроническая гранулематозная болезнь спектр клинико-лабораторных нарушений, тактика терапии // Педиатрия. 1991. -8. - С. 65-70. 3.// . . . - 1993. - . 67. - . 2-15. 4.,.С.,// . - 2006. - . 111. . 1-20. 5. Клиническая иммунология и аллергология Учебное пособие / Под ред. А.В. Караулова. - М. Медицинское информационное агентство, 2002. - 651 с. 6. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в Беларуси Справочник. - М. АстраФармСервис, 2007. - 976 с. 7. Патент 005626883, МПК 01 31/02, 1997. 8..,., -,-//.. - 1990. - . 62. - . 27-58. 9. Патент 0077188142, МПК 07 311/00,07 315/00, 2010. 10..,.,.,,- ( ) //. . . - 1985. - . 37.4. - . 449-459. 11. Клиническая фармакология по Гудману и Гилману / Под общ. ред. А.Г. Гилмана. В четырех томах. Кн. вторая. - М. Практика, 2006. - С. 557-558. 12..// . . . . - 1974. - . 291. - . 1187-1188. 13..,.,..//. 1984. - . 257. -3. - . 388-99. 14. - .//. . . - 1996. - . 56. - . 1. - . 341-57. 15. - .//. 16758 1 2013.02.28 16. Бизунок Н.А. Мелатонин модулирует генерацию активных форм кислорода в клеточных системах // Вести НАН Беларуси, медицинская серия. - 2006. -4. - С. 84-87. 17. Коваленко Е.И., Семенкова Г.Н. Хемилюминесценция активированных нейтрофилов в присутствии мелатонина //Молекулярная медицина и биохимическая фармакология. Материалы республиканской научной конференции / Под ред. П.С. Пронько, И.В. Зверинского. - Гродно, 2007. - С. 75-82. 18.,,,,,,, --В-// .. 2008. - . 52. - . 1. - . 121-127. 19..,.,.,.//. . - 2002. - . 2. - . 6. - . 767-774. 20. Бринкевич С.Д., Шадыро О.И. Влияние аскорбиновой кислоты и ее производных на радиационно-химические превращения гидроксилсодержащих органических соединений //Химия высоких энергий. - 2008. - Т. 42. -4. - С. 297-302. 21. Повалишев В.Н., Полозов Г.И., Шадыро О.И. Влияние -токоферола и его серосодержащих аналогов на радиационно-химические превращения гексана и этанола //Химия высоких энергий. - 2006. - Т. 40. -5. - С. 349-354. 22..,.,.,.,.,.К 3// .. - 2010. - . 102. - . 1224-1234. 23.,//. - 1992. - . 26. - о. 9-10. - . 657-676. 24..,.,.,, , ,23187//. . - 1988. - . 17. о. 3. - . 419-426. 25. Дуглас С.Д., Куи П.Г. Исследование фагоцитоза в клинической практике. - М. Медицина, 1983. - 112 с. 26.-.,,//. - 2006. - . 58. - . 621-681. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6