2-Пирролидинил-1-гидроксиметан-1,1-бисфосфоновой кислоты мононатриевая соль, проявляющая антирезорбтивную активность в сочетании с противоонкологическим действием

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ 2-ПИРРОЛИДИНИЛ-1-ГИДРОКСИМЕТАН-1,1-БИСФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ МОНОНАТРИЕВАЯ СОЛЬ, ПРОЯВЛЯЮЩАЯ АНТИРЕЗОРБТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ В СОЧЕТАНИИ С ПРОТИВООНКОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физикоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Куваева Зоя Ивановна Лопатик Дина Владимировна Хоменко Александр Игнатьевич Бондарева Ольга Михайловна Книжникова Анна Николаевна Рябикова Валентина Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физико-органической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 2-Пирролидинил-1-гидроксиметан-1,1-бисфосфоновой кислоты мононатриевая соль формулы проявляющая антирезорбтивную активность в сочетании с противоонкологическим действием. Изобретение относится к новому химическому соединению класса аминобисфосфонатов, а именно бисфосфоновому производному аминокислоты -пролинамононатриевой соли 2-пирролидинил-1-гидроксиметан-1,1-бисфосфоновой кислоты,16934 1 2013.04.30 которая проявляет антирезорбтивную активность, сочетающуюся с противоонкологическим действием, и может быть использована в медицине в качестве лекарственного средства при комплексной терапии метаболических остеопатий (для лечения первичного и вторичного остеопороза), а также при лечении некоторых видов злокачественных образований. Остеопороз - метаболическое заболевание костного скелета, для которого характерны низкая плотность костной массы с последующим увеличением хрупкости кости и предрасположенности к переломам. Данные мировой статистики свидетельствуют, что после 50 лет 30 женщин белой расы имеют остеопороз, с возрастом процент заболеваемости резко возрастает и к 70 годам достигает 70 . При раннем заболевании происходит дисбаланс процессов костного ремодулирования костеобразования и костной резорбции (преобладает ускоренная резорбция, либо снижение костеобразования, либо замедление обеих составляющих). Социальная значимость остеопороза определяется связанными с ним переломами позвонков и трубчатых костей (шейки бедра, костей предплечья, бедра). Если стоимость лечения обычного перелома составляет в среднем 2000 США, то лечение больного с остеопорозом достигает 11000 США. Ущерб от остеопороза в США достигает 1013 млрд дол. в год. Все лекарственные средства, применяемые для лечения и предотвращения остеопороза, условно делят на две группы средства, преимущественно угнетающие костную резорбцию - половые гормоны, бисфосфонаты, активные метаболиты, витамины 3 и препараты кальцитонина, а также средства, повышающие массу костной ткани - фториды,анаболики, активные метаболиты витамина 3 и активирующие ремодулирование структуры кости - бисфосфонаты. Таким образом, бисфосфонаты влияют на разные звенья этиопатогенеза остеопороза. Они вызывают наименьшее количество побочных эффектов по сравнению с другими классами соединений и поэтому их рекомендуют как наиболее активные препараты для лечения и профилактики остеопороза 1, 2. По своей структуре бисфосфонаты имеют сходство с эндогенным пирофосфатом и способны связываться с кристаллами гидроксиапатита костной ткани, содержащим группировку , что приводит к снижению активности остеокластов и торможению процесса развития костной резорбции. Считается, что бисфосфонаты индуцируют апоптез остеокластов, модулируют синтез противовоспалительных цитокинов и необратимо ингибируют пирофосфитазу кости. На фоне применения бисфосфонатов повышается минеральная плотность костной ткани, снижается риск возникновения переломов, наблюдается гипокальциемическое действие. В клинической практике для лечения заболеваний костных тканей используется ряд бисфосфонатов с различной антирезорбтивной активностью и модифицированными свойствами. Это лекарственные средства на основе алендроновой, золедроновой, ибандроновой, клодроновой, памидроновой, ризедроновой и этидроновой кислот 2. Известно, что терапевтическая активность этих препаратов зависит от природы органического радикала,связанного с бисфосфоновой группировкой. Наиболее высокой активностью обладают аминобисфосфонаты, содержащие в органическом радикале замещенные аминогруппы, а также азотсодержащие гетероциклы. К таковым относится и предлагаемая продроновая кислота. Класс бисфосфонатов оказался перспективным в лечении не только остеопороза. Запатентовано большое количество бисфосфонатов на основе карбоновых кислот различного строения, включая аминокислоты, предназначенные для лечения инфекционных заболеваний периодонта, мочевого тракта и рака костей 3. Свойство бисфосфонатов индуцировать апоптез остеокластов способствует тому, что они все активнее включаются в комплексную терапию при лечении злокачественных опухолей костей и костных метаста 2 16934 1 2013.04.30 зов при различных формах рака. Костная система является наиболее поражаемой при онкологических заболеваниях (рак молочной железы, рак предстательной железы, рак почек и щитовидной железы, рак легких). В онкологии дает положительные результаты применение аминобисфосфонатов - ибандроната, золедроната и памидроната натрия, которые способны также оказывать ингибирующее влияние на опухолевый остеолиз и гиперкальциемию опухолевого генеза. Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих терапевтическим антирезорбтивным действием при сочетании с ингибирующим действием на некоторые виды злокачественных образований. Поставленная задача достигается созданием нового соединения класса аминобисфосфонатов - 2-пирролидинил-1-гидроксиметан-1,1-бисфосфоновой (продроновой) кислоты в форме мононатриевой соли. Целенаправленное действие натрия продроната обусловлено его природой, так как он является производным аминокислоты -пролина, основного компонента из аминокислот, входящих в состав коллагена костей, связок и хрящевых тканей. Это обстоятельство должно обеспечить аминобисфосфонату на основе -пролина повышенное сродство к костной ткани и возрастанию его терапевтического эффекта при ингибировании процессов костной резорбции. Заявляемое соединение синтезируют взаимодействием -пролина с трихлоридом фосфора и фосфористой кислотой до образования промежуточного продукта присоединения,который подвергают гидролизу до получения продроновой кислоты, из которой затем действием натрия гидроокиси получают мононатриевую соль - целевой продукт натрия продронат. Пример. Получение продроновой кислоты. 464 г (4,0 моль) -пролина и 1120 г ПЭГ-400 (полиэтиленгликоль с мол. массой 400) перемешивают в стеклянном реакторе в атмосфере азота до образования гомогенной смеси, в которую вводят при перемешивании 395 г (4,8 моль) фосфористой кислоты. Через 0,5 ч прибавляют небольшими порциями 528 мл (6,0 моль) треххлористого фосфора при температуре 35-40 С, затем температуру повышают до 7580 С и выдерживают при перемешивании в течение 2-3 ч. Реакционная смесь постепенно густеет и превращается в плотную массу. После охлаждения до комнатной температуры полученную массу осторожно растворяют, прибавляя 2 л воды небольшими порциями. Раствор фильтруют и кипятят в течение 2-3 ч, затем охлаждают. Выпавший осадок отделяют, обрабатывают при нагревании и перемешивании в течение 1-2 ч 2000 мл 50 -ного этанола, осадок отфильтровывают и сушат при 55-60 С на воздухе. Получают 560 г продроновой кислоты моногидрата в виде белого порошкообразного вещества с температурой плавления 170-172 С. Продроновая кислота малорастворима в воде, спирте и ацетоне. Данные элементного анализа 513722. Молекулярная масса 279. Найдено,21,335,755,2222,23. Вычислено,21,525,415,0122,19. Получение натрия продроната. 560 г (2,0 моль) продроновой кислоты суспендируют в 2000 мл дистиллированной воды, вводят при перемешивании небольшими порциями 400 мл 5,0 водного раствора натрия гидроокиси (2,0 моль), доводят раствор до значения 3,3-3,4, перемешивают 0,5 ч с активированным углем и фильтруют. В полученный раствор вводят 3000 мл 96 этанола при нагревании до 50-55 С, охлаждают при перемешивании до комнатной температуры и оставляют на несколько час в холодильнике при 810 С. Осадок отделяют, сушат при 55-60 С на воздухе и получают 500 г натрия продроната моногидрата, представляющего собой белое порошкообразное вещество с температурой плавления 247-250 С. Натрия продронат легкорастворим в воде, малорастворим в спирте и ацетоне. При сушке при температуре 140 С получают безводный продукт. 3 16934 1 2013.04.30 Данные элементного анализа натрия продроната моногидрата 51272 2 мол. масса 301,10. Найдено,19,906,204,5319,977,41 2 6,03. Вычислено,19,934,654,6520,807,64 2 5,98. Данные элементного анализа натрия продроната безводного 51272 мол. масса 283,10. Найдено,21,035,904,7921,287,89. Вычислено,21,204,244,8421,888,12. Данные ИК и ЯМР спектроскопии подтверждают структуру полученного нового аминобисфосфоната - натрия продроната. Исследование специфической активности натрия продроната как ингибитора резорбции костных тканей было проведено в ГУО Белорусская медицинская академия последипломного образования. Экспериментальное исследование натрия продроната осуществляли на 110 белых крысах-самках массой 240-289 г, подвергнутых операции овариоэктомии (удаление яичников). Для опыта брались половозрелые животные без видимых признаков заболевания,охотно поедавшие корм, предварительно прошедшие 2-недельный карантин. После проведенной операции овариоэктомии у животных развивается дефицит эстрогенов, который имеет место у женщин в постменопаузальном периоде, происходят значительные метаболические сдвиги в гормональном обмене нарушается продукция паратиреоидного гормона, кальцитонина, кальцитриола, метаболитов витамина 3, уменьшается абсорбция кальция, резко увеличиваются процессы резорбции костной ткани. В связи с этим, данная модель широко применяется в экспериментальной фармакологии, так как она наиболее адекватно отвечает требованиям, предъявляемым к поиску лекарственных средств, применяемых для лечения и профилактики остеопороза. Не позже чем через 3 суток после операции крысам-самкам утром натощак ежедневно вводили натрия продронат внутрижелудочно в дозе 30 мг/кг массы тела и внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг. Экспериментальные данные по изучению воздействия на организм натрия продроната после овариоэктомии сравнивали с контролем - овариоэктомированными крысами и биологическим контролем - интактной костью. Для более детального анализа степени минерализации кости определялось соотношение минеральной, органической и водной фаз. Лечение овариоэктамированных крыс натрия продронатом в течение 3 месяцев показало, что в сравнении с контрольной группой явные морфологические признаки остеопороза отсутствовали, а сама костная ткань была обычного строения, межбалочное пространство выполнено миелоидным костным мозгом, местами встречаются участки образования молодого костного вещества. При изучении компонентов костной ткани оказалось, что содержание водной фазы у крыс-самок повышалось уже через 1 месяц после операции, при этом к этому сроку происходило и снижение неорганической фазы, при этом проявлялась тенденция к повышению содержания органической фазы (таблица). Из приведенных в таблице результатов видно, что на 2-3 месяц эксперимента уровень водной фазы был почти в 3 раза выше, а органической фазы в 1,5 раза выше по сравнению с нормой (интактная кость). В то же время содержание неорганической фазы снижалось в 1,4-1,5 раз. Проводимое лечение с использованием натрия продроната, начиная с первого месяца лечения, понижает уровень содержания водной фазы, который через 3 месяца становится статистически достоверным и достигает показателей нормы. 16934 1 2013.04.30 Влияние лечения овариоэктамированных крыс-самок натрия продронатом на состав костной ткани Состав костной ткани,Серия опытов Органическая фа- Неорганическая Водная фаза за фаза Контроль, интактная кость 8,621,14 25,080,45 64,320,21 Овариоэктомия, 1 месяц 22,394,34 34,192,98 43,423,61 Натрия продронат, 1 месяц 17,053,87 37,164,55 45,794,11 Овариоэктомия, 2 месяца 24,133,28 33,184,11 42,692,99 Натрия продронат, 2 месяца 14,464,02 36,463,62 47,083,96 Овариоэктомия, 3 месяца 23,494,43 34,492,62 42,025,18 Натрия продронат, 3 месяца 10,154,61 33,974,73 55,884,61 Установлено, что лечение натрия продронатом одновременно со снижением содержания водной фазы повышает содержание неорганической фазы. Это возрастание составляет 14 по сравнению с нелеченными крысами. На 3-й месяц после лечения повышается содержание минеральной фазы кости на 14 и снижается доля водной фазы на 13 в общей массе костной ткани по сравнению с экспериментальной группой животных. Таким образом, морфологически показано, что натрия продронат задерживает резорбцию костной ткани, а явные морфологические признаки остеопороза в группе леченных животных отсутствуют. Костная ткань обычного строения, межбалочное пространство выполнено миелоидным костным мозгом, местами встречаются участки образования молодого костного вещества. Введение препарата не оказало на костную ткань патологического воздействия. Изучение острой и хронической токсичности проводилось в опытах на мышах и крысах. Для этих целей использовались здоровые половозрелые самцы крыс массой 200-270 г и мышей массой 18-30 г. Найдено, что 50 продроната натрия равно 37068 мг/кг при внутрибрюшинном введении животным, при внутрижелудочном 50 4150595 мг/кг, что позволяет отнести натрия продронат кклассу малотоксичных химических веществ 4. Исследование противоопухолевой активности натрия продроната проводилось в ГНУ Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси. Противоопухолевая активность натрия продроната была изучена на тест-системах стабильных линий клеток миеломы человека -9, остеосаркомы человека -2- и карциномы молочной железы человека -75-1. Отработку условий субкультивирования образцов стационарного полностью охарактеризованного клеточного материала, проверку качества сред питания и ростовых факторов, подборку оптимальных условий для роста клеток каждой линии опухоли, запуск(разгон), проверку качества роста клеток и проведение эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями методических указаний 5. Для сравнения противоопухолевой активности натрия продроната была использована информация о цитостатическом влиянии памидроната (аминобисфосфонат на основе (аланина), полученная из литературных источников 6, 7. Проведенные испытания противоопухолевой активности натрия продроната с использованием клеток миеломы человека линии -9 несомненно свидетельствуют о том, что новый бисфосфонат оказывает статически существенное циторедуктивное влияние на растущие опухолевые клетки множественной миеломы человека. Натрия продронат в дозе 10 мкМ при контакте с миеломными клетками в течение 72 ч угнетает рост злокачественных клеток на 35 . Это максимальный цитостатический эффект тестируемого аминобисфосфоната, который начинает уменьшаться при увеличении дозы препарата до 50 мкМ. 5 16934 1 2013.04.30 Натрия продронат проявляет циторедуцирующее влияние на миеломные клетки в диапазоне концентраций от 10 до 50 мкМ. Сравнивая экспериментальные данные для продроната и приводимые в литературных источниках для памидроната можно прийти к выводу, что тестируемый аминобисфосфонат начинает проявлять противоопухолевую активность в гораздо меньших концентрациях (1-20 мкМ) по сравнению с эталоном, но, вероятно, уступает последнему по величине циторедуцирующего эффекта. В целом можно считать обоснованным, что натрия продронат оказывает весьма существенное цитостатическое действие на миеломные клетки и по активности сопоставим с памидронатом, что, вероятно, связано с избирательным действием аниона продроната на остеокласты. В исследованиях с использованием культуры клеток остеосаркомы человека линии-2 установлено, что антипролиферативный эффект натрия продроната в дозах до 20 мкМ при контакте с растущими клетками остеосаркомы можно оценивать как тенденцию к проявлению противоопухолевого эффекта. По результатам исследований натрия продронат (40 мкМ) при контакте с растущими клетками линии -75-1 карциномы молочной железы в течение 48 ч ингибировал пролиферацию раковых клеток на 25 относительно контрольных клеток. Установленная противоопухолевая активность натрия продроната позволяет рассматривать его как перспективный новый аминобисфосфонат для клинической апробации у пациентов с миеломной болезнью и злокачественной опухолью молочной железы, метастазирующей в костную систему. Таким образом, новое соединение класса аминобисфосфонатов 2-пирролидинил-1 гидроксиметан-1,1-бисфосфоновой кислоты мононатриевая соль (натрия продронат) обладает ценным сочетанием фармакологических свойств. Оно является с одной стороны антирезорбтивным средством, ингибирующим резорбцию костных тканей, с другой стороны - проявляет противоопухолевую активность по отношению к некоторым видам злокачественных новообразований. Источники информации 1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд.13. - Т. 2. - Харьков, 1998. - С. 152-153. 2. Матковская Т.А., Попов К.И., Юрьева Э.А. Бисфосфонаты. Свойства, строение и применение в медицине. - М. Химия, 2001. - 224 с. 3. Патент США 5854227, МПК 61 031/43, 1998. 4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М. Медицина, 2005. - С. 660-682. 5. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фар макологических веществ Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М. Ремедиум, 2000. - С. 324- 325. 6., // . . . - 2002. - . 20. - . 1.17. - . 3719-3736. 7..,.. // . . - 2009. - . 20. - . 1.8. - . 1330-1337. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6