Способ определения параметров флуоресценции пиреновой метки, встроенной внутрь одиночной или двойной цепочки олигонуклеотидов

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПИРЕНОВОЙ МЕТКИ, ВСТРОЕННОЙ ВНУТРЬ ОДИНОЧНОЙ ИЛИ ДВОЙНОЙ ЦЕПОЧКИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Галиевский Виктор Антонович Сташевский Александр Сергеевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения параметров флуоресценции пиреновой метки, встроенной внутрь одиночной или двойной цепочки олигонуклеотидов, в котором олигонуклеотид со встроенной пиреновой меткой помещают в буферный раствор и возбуждают пиреновую метку монохроматическим излучением с длиной волны, находящейся в спектральной полосе ее поглощения, регистрируют стационарные спектры флуоресценции и определяют квантовые выходы флуоресценции метки отдельно для мономерной и эксимерной формы пирена путем сравнения указанных спектров со спектрами известных стандартов, затем получают временные зависимости, характеризующие затухание сигналов флуоресценции для каждой из двух указанных форм пирена, одновременно в нано- и субнаносекундном временных диапазонах, и далее на первом этапе подвергают зависимости, полученные для наносекундного временного диапазона, экспоненциальной аппроксимации с определением по ее результатам значений кинетических параметров флуоресценции для соответствующих форм пирена, а на втором этапе для определения уточненных значений кинетических параметров аппроксимируют зависимости, полученные для субнаносекундного временного диапазона, подставив значения параметров, определенные на первом 15853 1 2012.04.30 этапе, в соответствующие им указанные аппроксимирующие функции, одновременно добавив в эти функции в качестве начальных слагаемых произвольно выбранные времена жизни и амплитуды дополнительных компонентов затухания. Изобретение относится к области флуоресцентной спектроскопии и может использоваться для исследования целевых молекули, в частности, с целью обнаружения вирусных нуклеиновых кислот. В ближайшей перспективе оно поспособствует улучшению характеристик флуоресцентных пиреновых гибридизационных зондов. Пиреновый гибридизационный зонд - последовательность нуклеотидов, комплементарная к определенному участку нуклеиновых кислот и содержащая флуоресцентную пиреновую метку, т.е. модифицированную молекулу пирена. Число нуклеотидов, использующихся в зондах, составляет обычно не более 20 единиц, и такую последовательность принято называть олигонуклеотидной или просто олигонуклеотидом. Для успешного конструирования и оптимизации флуоресцентных пиреновых гибридизационных зондов необходимо учитывать много различных факторов на каждом этапе, начиная с синтеза флуоресцентных пиреновых меток и заканчивая экспериментами. Основными параметрами, определяющими вклад флуоресцентной пиреновой метки и на которые ориентируются исследователи в этой работе, являются следующие количественные характеристики флуоресцентных пиреновых меток величины квантовых выходов флуоресценции (общие и рассчитанные для мономерной и эксимерной форм пирена), времена жизни и соотношения амплитуд кинетик свечения обеих пиреновых форм, время нарастания эксимерного свечения и степень влияния на эти величины молекул из окружения флуоресцентных пиреновых меток. Известен способ 1 регистрации стационарного спектра флуоресценции флуоресцентной пиреновой метки для определения в буферном растворе целевых последовательностей нуклеиновых кислот с помощью пиренового гибридизационного зонда. По форме получаемого спектра флуоресцентной пиреновой метки можно судить о соотношении флуоресцентных пиреновых форм (мономерной и эксимерной) и соответственно о факте связывания гибридизационного зонда с искомой последовательностью. В известном способе отсутствуют количественные характеристики свечения флуоресцентных пиреновых меток до и после гибридизации, которые могут помочь в создании новых более продуктивных меток и зондов. Известен способ 2 построения нестационарных спектров флуоресценции флуоресцентных пиреновых меток путем измерения интенсивностей их свечения в зависимости от времени на различных длинах волн в диапазоне от 350 до 600 нм. Он служит для обнаружения в буферном растворе с клеточным экстрактом целевых последовательностей нуклеиновых кислот с помощью пиренового гибридизационного зонда. По наличию полосы,соответствующей эксимеру пирена, судят о сближении двух мономеров, что говорит о присутствии в растворе искомой последовательности. Однако в данном способе отсутствует информация о быстропротекающих процессах при взаимодействии между флуоресцентными пиреновыми метками и соседними молекулами, в частности, неизвестны скорости образования эксимеров пирена. Наиболее близким по технической сущности является способ 3 определения параметров свободных флуоресцентных пиреновых меток в этаноле путем измерения спектров поглощения и флуоресценции, определения времени жизни мономерной формы пирена и квантовых выходов флуоресценции различных флуоресцентных пиреновых меток. В известном способе недостает информации о параметрах флуоресцентных пиреновых меток внутри олигонуклеотидных цепочек. Используется этанол, который не применим в 15853 1 2012.04.30 качестве модельной среды для биологических молекул. Не производится также расчет квантового выхода флуоресценции отдельно для мономера и эксимера пирена. Техническая задача - увеличение достоверности при характеристике веществ путем увеличения информативности. Поставленная техническая задача решается тем, что способ определения параметров флуоресценции пиреновой метки, встроенной внутрь одиночной или двойной цепочки олигонуклеотидов, в котором олигонуклеотид со встроенной пиреновой меткой помещают в буферный раствор и возбуждают пиреновую метку монохроматическим излучением с длиной волны, находящейся в спектральной полосе ее поглощения, регистрируют стационарные спектры флуоресценции и определяют квантовые выходы флуоресценции метки отдельно для мономерной и эксимерной формы пирена путем сравнения указанных спектров со спектрами известных стандартов, затем получают временные зависимости,характеризующие затухание сигналов флуоресценции для каждой из двух указанных форм пирена, одновременно в нано- и субнаносекундном временных диапазонах, и далее на первом этапе подвергают зависимости, полученные для наносекундного временного диапазона, экспоненциальной аппроксимации с определением по ее результатам значений кинетических параметров флуоресценции для соответствующих форм пирена, а на втором этапе для определения уточненных значений кинетических параметров аппроксимируют зависимости, полученные для субнаносекундного временного диапазона, подставив значения параметров, определенные на первом этапе, в соответствующие им указанные аппроксимирующие функции, одновременно добавив в эти функции в качестве начальных слагаемых произвольно выбранные времена жизни и амплитуды дополнительных компонентов затухания. Сущность способа определения параметров флуоресцентных пиреновых меток поясняется фиг. 1-5. На фиг. 1 изображена структурная формула одной из использовавшихся флуоресцентных пиреновых меток 1,6-бискарбоксиамидпирен. На фиг. 2 - спектр поглощения и нормированный спектр флуоресценции 1,6-бискарбоксиамидпирена. На фиг. 3 представлен спектр поглощения и нормированный спектр флуоресценции двойной цепочки с разделением свечения на мономерное и эксимерное. На фиг. 4 показаны кривые затухания и соответствующие модельные функции сигналов эксимера 1 и мономера 2 пирена внутри двойной цепочки с двумя флуоресцентными пиреновыми метками при возбуждении на 298 нм. Пунктиром изображена функция отклика системы регистрации 3. На фиг. 5 - взвешенные отклонения для свечения эксимера 1 и мономера 2, представленные в единицах(1) / ,где- экспериментальный сигнал в зависимости от времени , - аппроксимированный сигнал в зависимости от времени . Способ реализуется следующим образом определяют спектры поглощения растворов одиночных и двойных цепочек олигонуклеотидов с флуоресцентными пиреновыми метками. Затем измеряют квантовые выходы флуоресценции флуоресцентных пиреновых меток отдельно для мономерной и эксимерной формы (при наличии последней). Чтобы получить сигнал и рассчитать квантовый выход флуоресценции только эксимера, отмасштабированный сигнал мономера от соединения с одной меткой вычитают из суммарного сигнала более сложных соединений. В качестве стандарта при вычислении квантовых выходов флуоресценции используют раствор хинин-сульфата. После анализа спектров поглощения и флуоресценции записывают кинетики свечения на длинах волн, лежащих в соответствующих полосах мономерной и эксимерной формы пирена. Для каждой флуоресцирующей формы флуоресцентных пиреновых меток производят независимое измере 3 15853 1 2012.04.30 ние. На данной длине волны сигнал регистрируют в нано- и субнаносекундном временных диапазонах. Максимальные времена затухания сигнала, полученные в результате мультиэкспоненциальной аппроксимации на большой временной шкале, затем используют при анализе данных, полученных на малой шкале. Для соединений, обладающих и мономерной, и эксимерной флуоресценцией, применяют одновременную обработку начальных участков кинетических сигналов. Далее анализируют весь массив полученной информации и сопоставляют со структурными параметрами нуклеиновой цепи, непосредственно примыкающей к флуоресцентной пиреновой метке. В итоге выстроена картина взаимодействия флуоресцентных пиреновых меток и соседних молекул. Пример В фосфатном буфере 7,0 при комнатной температуре используемая флуоресцентная пиреновая метка (фиг. 1) обладает квантовым выходом флуоресценции 0,44 (фиг. 2) и временем жизни флуоресценции 60,9 нс. Затем флуоресцентную пиреновую метку (обозначим ) встраивают внутрь двух цепочек олигонуклеотидов с комплементарными основаниями(3). После их объединения (гибридизации) образована двойная цепочка олигонуклеотидов с двумя рядом расположенными флуоресцентными пиреновыми метками внутри спирали. Для нее отдельно рассчитанный квантовый выход флуоресценции мономерной формы пирена равен 0,0023, а эксимерной формы - 0,024 (фиг. 3). То есть после включения в двойную цепочку квантовый выход флуоресценции мономеров пирена уменьшился более чем на два порядка, а суммарный квантовый выход флуоресценции уменьшился более чем на порядок. Для выяснения причин произошедшего существенного уменьшения квантового выхода флуоресценции флуоресцентной пиреновой метки проведены измерения свечения, разрешенные во времени. Свечение мономера пирена на длине волны 395 нм и эксимера на длине волны 520 нм аппроксимировалось функциями вида где- суммарная интенсивность флуоресценции в зависимости от времени- номер слагаемого в сумме- число слагаемых в сумме- амплитуда -го компонента затухания- время жизни -го компонента затухания. После анализа кинетик в большом временном окне получены следующие значения амплитуди времен жизни(табл. 1). Таблица 1 1, нс (1) 2, нс (2) Мономер 7,17 (1,47) 1,66 (1,75) Эксимер 20,68 (0,90) 6,30 (1,33) Затем переходят к обработке данных, измеренных на малом временном интервале одновременному анализу начальных участков кинетик, при котором полученные значения времен жизни из табл. 1 фиксируют. В сумму (2) добавляют еще по одному слагаемому с одинаковым параметром . Параметры четвертых слагаемых могли изменяться произвольно. В результате имеем табл. 2 и фиг. 4, 5. 15853 1 2012.04.30 Таблица 2 1, нс (1) 2, нс (2) 3, пс (3) 4, пс (4) Мономер 7,17 (5,09) 1,66 (9,41) 160 (12,67) 4,22 (110,1) Эксимер 20,68 (2,61) 6,30 (21,42) 310 (7,55) 4,22 (-58,6) Компонент с общим временем жизни для мономерной и эксимерной форм пирена порядка 4 пс свидетельствует о быстром, но не доминирующем эксимерообразовании. Максимальные по длительности времена жизни - внутренняя релаксация мономера (около 7 нс) и эксимера (около 21 нс). Поэтому остальным параметрамсоответствует взаимодействие с соседними основаниями в двойной спирали. Относительные вклады слагаемых с этими временами жизни представлены в табл. 3 Таблица 3 2, нс (отн. 2) 3, пс (отн. 3) Мономер 1,66 (0,29) 160 (0,04) Эксимер 6,30 (0,71) 310 (0,01) Относительные амплитуды пересчитывались по формулеотн. 1. Следовательно, менее чем 1 квантовый выход флуоресценции мономера пирена в двойной цепочке олигонуклеотидов объясняется как образованием эксимера, так и тушением со стороны соседних оснований. В свою очередь, те же основания оказывают влияние и на величину квантового выхода флуоресценции эксимера в двойной цепочке олигонуклеотидов, хотя определяющая роль принадлежит неэффективному образованию эксимера из мономерных молекул пирена. Таким образом, и для мономера, и для эксимера пирена существенно взаимодействие с соседними основаниями, что находится в согласии с результатами, полученными в работе 4. Источники информации 1. , .-/ . , . , .// . . . - 2004. - . 69,10. . 3271-3275. 2./ Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6