Способ определения концентрации в биологической жидкости человека растворимого рецептора интерлейкина-8 второго типа

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА РАСТВОРИМОГО РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ВТОРОГО ТИПА(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гематологии и трансфузиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Акалович Светлана Тадеушевна Котлинский Константин Вячеславович Котлинская Юлия Владимировна Дорошенко Татьяна Михайловна Войтенок Николай Николаевич(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь(56).-.. . - 2008. .47. - . 150-157. ГУМЕННИКОВА Ю.В. Сборник работ 62-й научной конференции студентов и аспирантов Белгосуниверситета. - Минск, 2005. - С. 87-89.(57) Способ определения концентрации в биологической жидкости человека растворимого рецептора интерлейкина-8 второго типа 2, заключающийся в том, что образец биологической жидкости объемом исх концентрируют, разводят фосфатно-солевым буфером, после чего проводят конкурентный иммуноферментный анализ разведенного образца, при этом инкубируют разведенный образец с синтетическим пептидом , аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности-конца рецептора 2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и дополнительно содержит модифицированный биотином по -группе остаток цистеина на -конце, и моноклональными мышиными антителами , специфичными к -концевой части рецептора 2, проводят реакцию с тетраметилбензидином, измеряют оптическую плотность продукта реакции, по предварительно построенной калибровочной кривой вычисляют соответствующую данной оптической плотности концентрацию синтетического пептида,используемого в качестве стандарта, и определяют концентрациюрастворимого рецептора 2 в биологической жидкости по формуле 2 конц/исх,где- концентрация синтетического пептида, используемого в качестве стандарта- степень разведения концентрированного образца биологической жидкости, взятого для конкурентного иммуноферментного анализа конц - объем концентрированного образца биологической жидкости,15394 1 2012.02.28 причем в качестве стандарта используют синтетический пептид ,аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности -конца рецептора 2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и содержит остаток цистеина на -конце. Изобретение относится к области молекулярной иммунологии и может служить основой для создания нового диагностикума для количественного определения растворимого рецептора интерлейкина-8 второго типа 2 (2) в биологической жидкости человека, который отщепляется с поверхности нейтрофильных лейкоцитов при их активации, что может служить маркером вовлечения нейтрофильных лейкоцитов в патологические или физиологические процессы. Нейтрофильные лейкоциты (НЛ) крови играют центральную роль в антибактериальной защите организма. Антибактериальная функция НЛ связана с их миграцией из кровотока в ткани под действием специализированных хемотактических белков, -хемокинов. Интерлейкин-8 (ИЛ-8) является основным хемотактическим фактором для НЛ при воспалении 1. Свое действие ИЛ-8 оказывает через мембранные рецепторы 1 и 2,принадлежащие к серпентиновому семейству рецепторов, связанных с -белками. 1 и 2 имеют размер пептидных цепей около 40 кДа, содержат семь трансмембранных петель, внеклеточный -концевой домен, участвующий в связывании лиганда, и внутриклеточный -концевой участок, ответственный за передачу сигнала внутрь клетки 1, 2. 1 связывает с высокой аффинностью только ИЛ-8, а 2 реагирует на все основные -хемокины, ИЛ-8, -2, , -78 и -2 1. Изменение количества рецепторов на поверхности клеток является эффективным способом регуляции их способности отвечать на лиганды. Показано, что воспалительные факторы, такие как фактор некроза опухолей- (ФНО) и бактериальный липополисахарид, подавляют экспрессию рецепторов ИЛ-8 и реакцию НЛ на ИЛ-8 3, 4, 5. Нами ранее показано, что протеолиз с участием клеточно-связанных металлопротеаз является основным механизмом подавления экспрессии рецепторов ИЛ-8 на НЛ под влиянием фагоцитарных стимулов 6. Кроме того, опубликованы работы, в которых показано, что падение экспрессии 2 на НЛ под действием ФНО сопровождается образованием 40 кДа гликозилированной растворимой формы 2 7, 8. Известен способ определения 2, основанный на использовании вестернблоттинга и иммуно-слот-блот анализа, с помощью которыхК. и другие впервые описали высвобождение 2 в супернатант при активации нейтрофилов 4. Для выявления 2 нейтрофилы человека преинкубировали с поликлональными кроличьими анти-2 антителами и затем активировали в присутствии ФНО, полученный супернатант анализировали в вестерн-блоттинге. Отличие в количестве выявляемых на нитроцеллюлозной мембране кроличьих антител по сравнению супернатантом неактивированных клеток было идентифицировано как выявление продукта протеолитического отщепления рецептора 2 с поверхности клетки. В иммуно-слот-блот анализе авторам удалось показать, что количество выявляемых поликлональных кроличьих анти 2 антител в супернатанте активированных ФНО нейтрофилов вдвое выше по сравнению с контрольными клетками. Недостатком описанного способа определения 2 является как отсутствие результатов взаимодействия контрольных неспецифических кроличьих антител (изотипконтроль) в обоих вариантах определения, так и отсутствие прямого доказательства выявления 2 на нитроцеллюлозной мембране. Вывод о наличии продукта отщепления 2 делается на основании определения кроличьих антител и нет никаких данных о массе выделяемой молекулы 2. Более того, в данном сообщении использовались поликлональные кроличьи антитела, полученные к экстраклеточным доменам рецептора 2 15394 1 2012.02.28 2 человека, что не позволяет точно идентифицировать, какой именно из экстраклеточных доменов переходит в растворимую форму. Наиболее чувствительным способом определения растворимых белков является тестсистема с использованием моноклональных антител, специфичных к определяемому белку, на основе принципа конкурентного радиоиммунного или иммуноферментного анализа 9. Эти тест-системы основаны на конкуренции определяемого белка и его меченого аналога за центры связывания с иммобилизованными твердофазными антителами. Недостатком радиоиммунного анализа является необходимость введения радиоактивного йода в состав лиганда. Если в составе лиганда присутствуют аминокислотные остатки триптофан и метионин, то при мечении радиоактивным йодом возможно их окисление и последующие разрушение лиганда 10. В составе 2 содержится два остатка метионина и один остаток триптофана, что делает невозможным использование радиоактивного йода для мечения синтетических аналогов 2. Наиболее близким к заявляемому является способ определения 2, предложенный .-.и другими 11. Для определения 2 в супернатанте НЛ использовали сэндвич вариант иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на использовании моноклональных мышиных антител (-2,), распознающих аминокислотную последовательность 1-19 -конца рецептора 2 человека, и кроличьих поликлональных антител (АВса), специфичных к фрагменту 18-39 аминокислотной последовательности -конца рецептора 2 человека. Представленные результаты определения 2 свидетельствуют о наличии достоверного уменьшения количества выявляемого 2 в супернатанте при активации ИЛ-8 НЛ, выделенных из крови больных системной красной волчанкой, по сравнению с НЛ здоровых доноров. Недостатком известного способа является длительность выполнения и невысокие функциональные возможности, так как он применим только для количественного определения в супернатанте клеток с высокой концентрацией 2. Известный способ не может быть принят в качестве прототипа, так как не имеет общих признаков с заявляемым. Анализ опубликованных данных показал, что на сегодняшний день не описан способ прямого определения 2, применимый для биологических жидкостей организма. Задача заявляемого изобретения заключается в расширении возможностей способа определения 2, включающего определение 2 в образцах биологических жидкостей человека, повышении точности за счет исключения влияния на определение 2 низкомолекулярных примесей и сокращении времени его проведения. Поставленная задача достигается за счет того, что образец биологической жидкости объемом исх концентрируют, разводят фосфатно-солевым буфером, после чего проводят конкурентный иммуноферментный анализ разведенного образца, при этом инкубируют разведенный образец с синтетическим пептидом , аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности конца рецептора 2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и дополнительно содержит модифицированный биотином по -группе остаток цистеина на С-конце, и моноклональными мышиными антителами А, специфичными к концевой части рецептора 2, проводят реакцию с тетраметилбензидином, измеряют оптическую плотность продукта реакции, по предварительно построенной калибровочной кривой вычисляют соответствующую данной оптической плотности концентрацию синтетического пептида, используемого в качестве стандарта, и определяют концентрацию С растворимого рецептора 2 в биологической жидкости по формуле 2 конц/исх,где- концентрация синтетического пептида, используемого в качестве стандарта- степень разведения концентрированного образца биологической жидкости, взятого для конкурентного иммуноферментного анализа 3 15394 1 2012.02.28 конц - объем концентрированного образца биологической жидкости,причем в качестве стандарта используют синтетический пептид , аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности-конца рецептора 2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и содержит остаток цистеина на -конце. Сущность определения концентрации данного вещества в образце биологической жидкости (например, в моче) состоит в следующем. Образец мочи (500 мкл), предварительно отцентрифугированной (400 , 10 мин), помещают в концентратор Микрокон-10 , характеризующийся способностью концентрировать белки с молекулярной массой от 10 Да и выше, и центрифугируют при 10000 в течение 30-35 мин. Для перевода концентрата белковой фракции в ФСБ, необходимый для дальнейшего анализа образца, в концентратор дважды добавляют по 450500 мкл ФСБ и дважды центрифугируют при 10000 в течение 30-35 мин. Для сбора сконцентрированного раствора белка вставку концентратора с мембраной вставляют в новую пробирку вверх мембраной и центрифугируют при 1000 в течение 1-2 мин. Объем полученного концентрата должен составлять 25-100 мкл. Концентрат мочи можно хранить при -20 , повторное замораживание/оттаивание нежелательно. Для определения концентрации 2 подготовленный концентрат мочи проверяли в разработанном и заявляемом нами конкурентном иммуноферментном анализе (кИФА), основанном на принципе конкуренции немеченого синтетического пептида, содержащего 20 аминокислотных остатков, идентичных аминокислотной последовательности -конца рецептора 2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20, и аминокислотный остаток цистеина на -конце (, 1-20-), с модифицированным биотином производным этого же синтетического пептида (1-20 биотин) за специфическиеА, иммобилизованные на твердой фазе. Для выполнения кИФА полистирольные 96-луночные планшеты для ИФАзаполняют по 100 мкл на лунку 0,1 карбонатным буфером,9,6, содержащим 3 мкг/млА, и инкубируют 12-18 ч при 4 или в течение 2 ч при 37 . После трехкратной отмывки (здесь и далее по 200 мкл на лунку) ФСБ, содержащим 0,05 Твин-20 (ФСБ-Тв), в лунки вносят в качестве стандарта двукратные разведения пептида 1-20-С (от 200 до 3,1 нг/мл) в 50 мкл ФСБ-Тв,содержащем 0,5 бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-Тв-БСА), разведения (16,110, 118 или другое) опытных образцов в 50 мкл ФСБ-Тв-БСА, и в две контрольные лунки вносят 50 мкл ФСБ-Тв-БСА. После инкубации в течение 15 мин при встряхивании при 18-20 во все лунки вносят по 50 мкл ФСБ-Тв-БСА, содержащего биотинилированный пептид 1-20-С-биотин, и инкубируют в течение 35 мин в том же режиме (биотинилированный пептид 1-20 биотин используют в минимальном разведении, достаточном для достижения в контрольных лунках 2 единиц оптической плотности в течение 15-30 мин при инкубации с субстратным буфером с тетраметилбензидином). После трехкратной отмывки лунки планшета инкубируют со 100 мкл раствора конъюгата авидин-пероксидазы(12000, ) в ФСБ-Тв-БСА в течение 30 мин при встряхивании при 18-20 , четыре раза промывают лунки ФСБ-Тв и проявляют ферментативную реакцию, заполняя лунки микропланшет субстратным буфером с тетраметилбензидином. После инкубации в течение 10 мин в темноте реакцию останавливают 5 раствором серной кислоты. Учет результатов проводят на многоканальном спектрофотометре для микропланшет (например, ) при длине волны 450 нм. После построения калибровочной кривой по измеренной оптической плотности (ОП) определяют концентрацию 2 в анализируемом концентрате мочи. На чертеже представлена калибровочная кривая кИ-ФА по приведенному примеру. Концентрацию в исходном образце мочи рассчитывают по формуле, предложенной нами С 2 конц/исх,4 15394 1 2012.02.28 где- концентрация синтетического пептида, используемого в качестве стандарта- степень разведения концентрированного образца биологической жидкости, взятого для конкурентного иммуноферментного анализа конц - объем концентрированного образца биологической жидкости,причем в качестве стандарта используют синтетический пептид , аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности-конца рецептора 2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и содержит остаток цистеина на -конце. Чувствительность кИФА составляет 1,5 нг/мл. Чувствительность метода определения 2 при вышеописанном исполнении составляет 5 нг/мл мочи. В случае очень низкого содержания 2 ( 5 нг/мл) в тестируемом образце необходимо внести следующие изменения в этапы выполнения на один концентратор нанести больший объем мочи(например, 2 раза по 500 мкл), объем концентрата уменьшить до 20-30 мкл, увеличив время концентрирования образца, и уменьшить разведение полученного концентрата до 1213. Все внесенные изменения учитывают при расчете концентрации 2 в исходном образце. Предложенный способ позволил определить концентрацию 2 в образцах мочи здоровых доноров (20 доноров крови, 10 мужчин и 10 женщин, средний возраст 39,311 лет (здесь и далее указано среднее значениестандартное отклонение). Показано, что в норме у взрослого человека (старше 18 лет) концентрация 2 в моче составляет 29,77,8 нг/мл (20, минимальное значение 16,5 нг/мл, максимальное - 42,3 нг/мл). Проведенное нами предварительное изучение уровней 2 в моче больных с острым послеоперационным перитонитом позволило выявить значимое отличие концентрации 2 от наблюдаемой у здоровых доноров 7. Полученные данные указывают на возможную диагностическую и прогностическую значимость определения 2 при различных патологических состояниях и перспективность дальнейших исследований. В образце биологической жидкости с высоким содержанием растворимого рецептора этап концентрирования исключают. Для определения 2 в образцах плазмы крови или других средах с высоким содержанием тотального белка этап концентрирования заявляемого способа заменяется на этап иммуноаффинной сорбции с использованием, ковалентно связанных с сефарозой, с последующей элюцией сорбированного антигена и анализа элюата в вышеописанном кИФА. Заявляемый способ определения 2 иллюстрируется следующим примером. Пример. Донор крови А.И.В., мужчина, 44 года, дата сдачи крови и анализ мочи 29.12.08. Образец мочи (500 мкл) поместили в концентратор Микрокон-10 и центрифугировали при 10000 в течение 30 мин. Для перевода полученного концентрата в ФСБ в концентратор дважды добавили по 450 мкл ФСБ и дважды центрифугировали при 10000 в течение 30 мин. Для сбора сконцентрированного раствора белка вставку концентратора с мембраной вставили в новую пробирку вверх мембраной и центрифугировали при 1000 в течение 1 мин, как описано выше. Объем концентрата составил 102 мкл. Концентрат анализировали в кИФА согласно заявляемому способу. Относительно полученных значений оптической плотности (ОП) в лунках со стандартом построили калибровочную кривую, представленную на чертеже. В дуплете лунок с образцом исследуемого концентрата мочи значение ОП составило 1,232 единицы, что по калибровочной кривой соответствует 9,113 нг/мл. Подставив все необходимые значения в указанную выше формулу (9,11310 конц 0,102 мл, исх 0,5 мл), получаем значение концентрации 2 в исходном образце мочи 37,0 нг/мл, что соответствует диапазону концентраций 2 в моче здоровых доноров. Оставшийся концентрат хранили при -20 . Повторное опреде 5 15394 1 2012.02.28 ление концентрации 30.12.08 в том же концентрате позволило выявить 37,0 нг/мл 2. Источники информации 1..// . . . - 2001. - . 250. . 91-104. 2...-82-// . . - 1994. - . 152. - . 1783-1789. 3... -2.- // . . . 2001. - . 125. - . 414 - 422. 4... -2- // . . - 1998. - . 160. - . 4518-4525. 5..-2// . - 1999. - . 93. - . 2173-2185. 6...-12 // . - 2002. - . 100. - . 2668-2672. 7. Акалович С.Т. и др. Выявление и иммунохимическая характеристика растворимой формы рецептора 2 интерлейкина-8 человека // Доклады НАН Беларуси. - 2008. Т. 52. - С. 87-92. 8. Котлинский К.В. и др. Биохимическая характеристика растворимой формы рецептора 2 интерлейкина-8 человека // Известия НАН Беларуси. - 2009. - . 2. - С. 85-89. 9... -//. - 1983. - . 29. - . 168-170. 10. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6