Способ получения глюкозооксидазы

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Михайлова Раиса Владимировна Семашко Татьяна Владимировна Лобанок Анатолий Георгиевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ получения глюкозооксидазы, включающий внесение посевного материала грибав питательную среду, глубинное культивирование в условиях аэрации и последующее отделение культуральной жидкости, содержащей глюкозооксидазу, от биомассы гриба, отличающийся тем, что посевной материалвыращивают на агаризованной среде Чапека, содержащей 0,005-0,01 рибофлавина, а глубинное культивирование проводят на питательной среде, содержащей,мас.сахарозу 6,0 3 2,0 14007 1 2011.02.28 Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения путем микробиологического синтеза внеклеточных глюкозооксидаз, которые широко применяются в медицине в качестве реагента для энзиматического метода определения глюкозы в биологических жидкостях, в химической промышленности для получения глюконовой кислоты и глюконатов, в пищевой промышленности как антиоксидант и консервант. Известно, что продуцентами внеклеточных глюкозооксидаз являются грибы родови . Однако глюкозооксидазы, синтезируемые грибами рода , имеют более высокое сродство к глюкозе, чем аналогичные ферменты различных штаммов грибов рода . Так, для глюкозооксидаз родазначение константы Михаэлисаравно 23,7-37,0 миллимоль, а для глюкозооксидаз грибов рода- 3,3-19,0 миллимоль. Известен способ получения внутриклеточной глюкозооксидазы из мицелиального гриба 1. Недостатками этого способа являются необходимость постоянного поддержаниясреды на уровне 6,5 при культивировании гриба, синтез им внутриклеточного фермента и, как следствие, сложность и трудоемкость процесса очистки глюкозооксидазы. Известен способ образования глюкозооксидазы.при поверхностном выращивании 2 и Способ выделения глюкозооксидазы из культуральной жидкости продуцента.3, предусматривающий отделение мицелия, введение каолина в культуральную жидкость и отделение вместе с ним сорбированной на нем каталазы и извлечение глюкозооксидазы из полученного раствора осаждением спиртом и сушкой целевого продукта. Недостатками данных способов являются 1) поверхностный способ культивирования, сопровождающийся загрязнением воздуха рабочей зоны спорами гриба и, вследствие этого, повышением уровня заболеваемости персонала болезнями верхних дыхательных путей 4, 2) наличие в культуральной жидкости гриба более 50 балластных белков (в том числе и каталазы) и нерастворимых веществ, усложняющих процесс очистки фермента. Известен способ получения глюкозооксидазы на основе штамма 16 в условиях глубинного культивирования 5, 6. Недостатком данного способа является необходимость поддержания определенного уровняпитательной среды путем введения в среду нерастворимой соли (3), необходимость поддержания при культивировании высокой температуры (28 С), что делает процесс энергоемким, низкий выход целевого продукта и образование при выращивании гриба сопутствующего фермента внеклеточной каталазы, затрудняющей процесс очистки глюкозооксидазы. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является Способ получения внеклеточной глюкозооксидазы на основеМГУ 433 7, 8. Данный способ предусматривает культивирование продуцирующего микроорганизма .КМ МГУ 433 на питательной среде (исходный 6,8-6,9),содержащей источники углерода (сахарозу 8-12 ) и азота (нитрат калия 1-4 ), минеральные соли и микроэлементы. Посевной материал выращивают в пробирках на суслоагаре. Засев производят спорами гриба, используя культуру 3-8-недельного возраста. Гриб выращивают в колбах на качалке с 180 об/мин при 15-26 С в течение 5 суток. Уровень образования глюкозооксидазы, синтезируемой наиболее активным продуцентом.КМ МГУ 433, составляет 152 ед/мл культуральной жидкости (по методике 9) или 11 ед/мг внеклеточного белка. Недостатками данного способа являются использование для выращивания посевного материала и хранения культуры суслоагара - питательной среды, содержащей большое количество углеводов, что может привести к нестабильности гриба вследствие гетерокариоза 14007 1 2011.02.28 выращивание гриба при высоком исходном значениисреды (6,8-6,9) и конечном(5,0), что может создавать условия для контаминации бактериальной инфекцией длительность культивирования гриба (120 ч), что удорожает процесс низкая удельная активность синтезируемой глюкозооксидазы (11 ед/мг белка), что свидетельствует об образовании в процессе культивирования большого количества балластных белков, затрудняющих процесс очистки глюкозоокисляющего фермента. Задачей предлагаемого изобретения является стабилизация культур продуцентов, повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса его получения. Поставленная задача решается путем выращивания штаммовдля получения посевного материала на агаризованной среде Чапека с рибофлавином, глубинного культивирования грибов на питательной среде, не содержащей 24, с исходным 5,0-5,2 (конечным 3,4-3,6), в условиях аэрации с последующим отделением биомассы и использованием фильтрата культуральной жидкости для получения препаратов глюкозооксидаз. Продуценты глюкозооксидазы - штаммы.15.3,.95.132, .14.1, .27, .28.25,.39.10, .46.1, .56, хранящиеся в коллекции лаборатории ферментов Института микробиологии НАН Беларуси. Для поддержания и хранения грибов используют агаризованную среду Чапека с 0,005-0,01 рибофлавина. Культивирование грибов ведут на питательной среде, содержащей в качестве соли калия , с исходным 5,0-5,2. Представленная среда является оптимальной для получения глюкозоокисляющего фермента. Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления. Пример 1. В качестве объектов исследования используют .15.3, .95.132, .14.1, .27, .28.25, .39.10,.46.1, .56. Штаммы поддерживают на агаризованных средах Чапека или Чапека с добавлением рибофлавина. Культуры пересевают не реже 1 раза в 4 месяца на вышеуказанные среды. Для анализа биохимической стабильности штаммы культивируют на питательной среде следующего состава ( ) сахароза - 6,0 3 - 2,0 24 - 0,1- 0,1 4 0,05 34 - 0,001 4 - 0,001 4 - 0,0001 2 - 0,00005 24 - 0,00005 4 - 0,00005 исходный 5,0-5,2. В качестве посевного материала используют споровые суспензии (2,5-5104 спор/мл среды) грибов, выращенных на вышеуказанных агаризованных средах при 24-26 С в течение 14 сут. Культивирование грибов ведут глубинно в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на круговой качалке(180-200 об/мин) при температуре 24-26 С в течение 92-94 ч. По окончании культивирования биомассу грибов отделяют фильтрованием. В фильтрате культуральной жидкости определяют количество глюкозооксидазы спектрофотометрическим методом, основанным на энзиматическом превращении бензохинона в гидрохинон 10, 11, где за единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует образование 1 миллимоль 22 в течение 1 мин при 25 С. Установлено, что оптимальной для выращивания посевного материала и дальнейшего поддержания и хранения штаммов .является среда Чапека с рибофлавином. Уже при минимальном его внесении наблюдался положительный эффект на стабилизацию культур. Наилучший результат получен при внесении рибофлавина в количестве 0,0050,01 . Дальнейшее увеличение концентрации рибофлавина в среде нецелесообразно, поскольку ведет к ингибированию роста культур. Поскольку результаты, полученные при использовании в качестве посевного материала грибов, выращенных на агаризованной 14007 1 2011.02.28 среде Чапека с 0,005 и 0,01 рибофлавином, практически не отличались. В табл. 1 для сравнительного анализа представлены данные только одного из вариантов опытов. Таблица 1 Агаризованная среда для выращивания культур Чапека Чапека с 0,01 рибофлавином Штаммы ГлюкозоГлюкозо.Коэффициент Коэффициент ваоксидазная активоксидазная активвариации,риации,ность, ед/мл ность, ед/мл 15.3 6,450,80 12,4 6,900,38 5,5 95.132 11,201,79 16,0 12,300,78 6,3 14.1 9,324,42 47,4 10,102,22 22,0 27 11,233,91 34,8 13,921,50 10,8 28.25 13,606,89 50,7 14,291,63 11,4 39.10 11,605,80 50,0 12,872,40 18,6 46.1 12,131,71 14,1 18,100,89 4,9 56 11,303,85 34,1 12,642,64 20,9 Представленные в табл. 1 данные показывают, что в результате использования для получения посевного материала грибов, поддерживаемых на среде Чапека с рибофлавином,увеличивается уровень синтеза фермента и снижается коэффициент вариации, что свидетельствует о стабилизации культур. Следует отметить, что при хранении грибов на среде с рибофлавином культуры сохраняют свою активность в течение 3-7 лет. Пример 2. В качестве объектов исследования используют 3 штамма .15.3, 95.132 и 46.1. Процесс ведут на среде прототипа 7. Условия культивирования аналогичны описанным в примере 1. Количество глюкозооксидазы в фильтратах культуральных жидкостей определяют колориметрически с о-дианизидином по методу 9, где за единицу глюкозооксидазы принимается то количество фермента, которое разлагает 1 микромоль -глюкозы за 1 мин, и спектрофотометрически методом 10, 11, описанным в примере 1. Таблица 2 Глюкозооксидазная активГлюкозооксидазная активШтаммы ность, ед/мл, определяемая Конечный рН ность, ед/мл, определяемая.по методу 9 аналогично по методу 10, 11 прототипу 15.3 4,7 52,7 3,2 95.132 4,7 107,0 6,5 46.1 4,5 155,1 9,4 В табл. 3 условия примера соответствуют вышеописанным в данном примере за исключением того, что процесс ведут на среде прототипа без добавления в среду 24 что позволяет снизить исходныйсреды до 5,0-5,2. Таблица 3 Глюкозооксидазная активГлюкозооксидазная активШтаммы ность, ед/мл, определяемая Конечныйность, ед/мл, определяемая.по методу 9 аналогично по методу 10, 11 прототипу 15.3 3,6 79,1 4,8 95.132 3,4 156,8 9,5 46.1 3,4 216,0 13,1 4 14007 1 2011.02.28 Как видно из табл. 2 и 3, в отсутствии в среде 24 уровень синтеза фермента грибами увеличился на 40-50 , а значения конечногосреды уменьшаются до 3,4-3,6. Пример 3. Условия примера соответствуют описанным в примере 2 (табл. 3) за исключением того, что процесс ведут добавляя в среду в качестве минеральной соли(источник ионови ) в различных концентрациях. В качестве объекта исследования использован наиболее активный штамм .46.1. Таблица 4 Глюкозооксидазная активность,Концентрация Глюкозооксидазная активность, ед/мл,ед/мл, определяемая по методу) Согласно данным, представленным в табл. 4, введение в средупозволяет улучшить выход фермента на 37-38 по сравнению с контролем и на 94-95 по сравнению с аналогичным показателем прототипа. Пример 4. Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что глюкозооксидазную активность определяют по методу 9 аналогично прототипу. Как видно из табл. 5, выращивание предлагаемым способом обеспечивает высокий уровень образования фермента, а удельная активность грибов возрастает более чем в 40 раз. Таблица 5 Глюкозооксидазная активность Штаммы Конечныйед/мг белка (удельная ак.ед/мл тивность) 15.3 3,5 122,1 445,6 95.132 3,5 203,0 520,4 14.1 3,6 166,7 496,0 27 3,4 228,8 520,1 28.25 3,4 211,7 534,6 39.10 3,6 235,5 490,6 46.1 3,6 300,1 572,7 56 3,5 208,1 533,5 КМ МГУ 433 152,0 11,0(прототип) 7, 8 Преимущество предлагаемого способа получения глюкозооксидазы 1. Стабилизация свойств продуцентов за счет использования для поддержания культур и получения посевного материала агаризованной среды Чапека с 0,005-0,01 рибофлавином. 5 14007 1 2011.02.28 2. Образование фермента с высокой удельной активностью, что свидетельствует о низком содержании сопутствующих белков и облегчает дальнейший процесс очистки глюкозооксидазы. 3. Сокращение срока культивирования, что позволяет снизить энергозатраты и обеспечить рентабельность процесса. 4. Выращивание грибов в кислой среде ( 5,0-5,2 против 6,8-6,9), что позволяет снизить возможность контаминации бактериальными инфекциями. Источники информации 1. ,/ . , , .// . . . - 1997. - . 48. - . 34-40. 2. Витковская В.А., Вакуленко В.А., Лаврищева Т.Н. и др. К уточнению режима поверхностного культивирования продуцента глюкозооксидазы. Труды УкрНИИСП, 1965. Вып. 10. - С. 164-172. 3. А.с. СССР 1074137, МПК 129/04, 1981. 4. Закаляк Н.Р. Ггенчнатоксилогчна характеристика грибаяк промислового штаму у виробництв мкроциду та глюкозооксидази 2005 годаАвтореф. дис. канд. мед. наук 14.02.01. Львв. нац. мед. ун-т м. Д. Галицького. - Л., 2005. - 20 с. 5..,.16// . . . - 1993. - . 75. - . 369-372. 6.,,.,.,.,. ,16 / // . . . - 1995. - . 22. - . 169-178. 7. Патент РФ 2170762, МПК 7 212 1/14, 9/04, 2001 (прототип). 8. Сухачева М.В., Давыдова М.Е., Нетрусов А.И. Получение и свойства глюкозооксидазы из 433 // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. Т. 40. -1. - С. 32-36 (прототип). 9.,.,.//. . . -. -. - 1974. - . 1. . 457-458. 10..,.// . . - 1984. - . 17. - . 1417-1427. 11..,,// . . . - 1989. - . 30. -2. - . 166-169. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6